Denne protokol beskriver, hvordan du udfører cellernes levedygtighed og fluorescens udtryk analyser ved hjælp af Tali Billed-Based cytometer.
Enkelt-celle og befolkningen information er almindeligt fås enten ved flowcytometri eller fluorescens mikroskopi. Men disse to metoder giver forskellige informationer. Flowcytometri giver kvantitative multi-parametrisk oplysninger om fysiske egenskaber og farvning eller udtryk, men giver ikke mulighed for visualisering. Stand-alone fluorescensmikroskopi indeholder visuelle data, men tillader ikke ved ukomplicerede kvantitative målinger 1.
Billed-baserede cytometri bygger bro mellem disse to metoder, der muliggør hurtig visualisering og samtidig kvantitativ analyse af tusindvis af celler i heterogene populationer 2. Her præsenteres en metode til udførelse af cellernes levedygtighed og grønne fluorescerende protein (GFP) udtryk analyser ved hjælp af Tali Billed-Based cytometer 3. Den Tali instrument er en 3-kanal (lyse felt, grøn fluorescens, rød fluorescens) benchtop assay platform, der offers flere fordele i forhold til flowcytometri og fluorescens mikroskopi. Den Tali cytometeret er billigere, optager mindre bænk plads, kræver mindre vedligeholdelse, og det arbejde flow er blevet forenklet, så drift og analysen er meget enklere og hurtigere. Den Tali cytometeret er i stand til at udføre en række suspension cellebaserede assays, herunder GFP og rød fluorescerende protein (RFP) udtryk, apoptose 4-6 og cellernes levedygtighed analyse med propidium iodid (PI) 7-11.
Her vil vi demonstrere brugen af Tali instrument i udførelsen af en celle levedygtighed assay i celler, der udtrykker GFP. GFP-transduced celler farves ved hjælp af Tali Levedygtighed Kit – Dead Cell Rød. Cellerne bliver derefter afpipetteres i en Tali Cellular Analyse Skub og indlæses i cytometret. Bright felt, rød fluorescens og grøn fluorescens billeder er taget til fange og analyseres ved hjælp af assay specifikke algoritmer. Histogrammer bliver derefter genereret for at få vist celle størrelse, PI Fluorescence intensitet, og GFP fluorescensintensitet. Disse parametre kan derefter thresholded komme ind på en bestemt celle population.
En side om side sammenligning af Tali Billed-baserede cytometer og traditionelle flowcytometri viser, at de to metoder giver sammenlignelige data om cellernes levedygtighed og protein udtryk. Men den Tali instrumentet giver yderligere visuel information om cellepopulation, der ikke kan opnås ved hjælp af et flowcytometer.
Vi har netop detaljeret en procedure for udførelse af levedygtighed tæller og vurdere GFP udtryk ved hjælp af Tali Billed-Based cytometer. Ved hjælp af samme procedure, denne cytometer er i stand til at udføre en række andre analyser, herunder: apoptose, RFP og celle levedygtighed og analysen ved hjælp af ikke-transduced celler.
Fluorometric analyser af cellernes levedygtighed, genekspression og apoptose er blevet centrale metoder i biomedicinsk forskning 7-12. I fortiden, separate instrumentering er blevet brugt til at fremskaffe kvantitative og visuel information om celler. Mens kvantitative oplysninger om celler i en heterogen population er blevet vundet ved hjælp af flowcytometri, har visuel eller kvalitative oplysninger blevet indsamlet ved hjælp af fluorescensmikroskopi 1-4. Her præsenterer vi en teknologi, der bygger bro mellem befolkningen og enkelte celle studier. Brug af Tali Billed-Based cytometer, kvantitative daTA og visuel celle data om de enkelte celler eller cellepopulationer kan indsamles samtidigt. Den Tali instrument kan bruges til en række applikationer, herunder vurdering af genekspression, apoptose analyser, undersøgelser af narkotika effekt, og vurdering af sygdomsprogression.
Den Tali Billed-Based cytometer indfanger og analyser lyse-feltet, rød fluorescens og grøn fluorescens billeder, der giver oplysninger om delpopulationer af celler, der skal indhentes. For eksempel, i denne analyse var vi i stand til at skelne døde celler fra levende celler inden for GFP-udtrykkende cellepopulation hjælp Dead Cell rød farve. Dette giver præcision i målingen af levedygtige celler, der udtrykker GFP, og identificerer befolkningen i cellerne brugbare for downstream-behandling. Det er vigtigt at bemærke, at de døde celler i befolkningen kunne opstå fra forskellige kilder, herunder normal celledød i kultur-eller celledød forårsaget af miljømæssige forhold (f.eks, trypsinization eller deATH foranlediget af transfektion / transduktion valgte metode).
Her har vi demonstrere brugen af Tali cytometret med U2OS celler. Lignende metoder kan udføres ved hjælp af de fleste pattedyr og insekter celler. For hver cellelinie, produceret Tali cytometret kvantitative GFP udtryk data, hvilket ikke er muligt med en visuel inspektion af celler ved hjælp af en standard fluorescens mikroskop. Selv om disse resultater er sammenlignelige med flowcytometri, er de samlet i en brøkdel af tiden. Cytometret er i stand til præcist at tælle celler mellem 5 m til 60 ìm i diameter, helst i en koncentration på 1 x 10 5 til 1 x 10 7 celler / ml.
Det er vigtigt at påpege, at de fleste standard farvning protokoller, herunder Dead Cell Røde farvningsprotokol beskrevet her, kan du bruge propidium iodid til at skelne mellem levende og døde celler. Dette er en udfordring, når de vurderer levedygtigheden i celler, der har været permeabilized for staining af intracellulære markører, da PI vil pletten enhver celle med en kompromitteret membran. Da enhver fluorescerende farvestof eller protein, som kan opdages med den grønne eller røde fluorescens kanaler kan analyseres på Tali Billed-Based cytometer, kan fremtidige studier undersøge brugen af alternative farvestoffer, som amin reaktive levedygtighed farvestoffer 4. En undersøgelse fra 2006 af Perfetto et al. 12 fundet disse farvestoffer til at være nem at bruge og reproducerbar i diskriminerende levende og døde cellepopulationer.
Bemærk, at Tali har begrænsninger med hensyn til typer af assays det kan udføre. For eksempel, da formålet bruges af instrumentet er 4X regner begrænsede til større celletyper: sub-cellulære strukturer såsom mitokondrier eller vesikler, og bakterielle celler kan ikke kvantificeres. Bemærk også, at påvisning kanalerne i Tali er begrænset til fluorophores, der vil begejstre og udsender inden for de kanaler. Mens YFP og lyse mCherry signaler cen påvises, lysdæmper mCherry signaler ikke kan. Endelig Tali kun analyser celler i suspension. Det vil ikke nøjagtigt tælle celler at tilslutte sig et dias. Hertil kommer, mens der er kun begrænset kapacitet til at tælle celler, der er uregelmæssigt formet, herunder nogle gær og primære celler.
Desuden vil fremtidige undersøgelser sandsynligvis løse problemet med brug af dette system i forbindelse med vurderingen udtryk for intracellulære markører. Individuelle farver kan tjekkes for spektrale overlap med tilstødende kanaler, ved hjælp af Invitrogen online SpectraViewer værktøj ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). I betragtning af det nye i denne teknologi, har hele spektret af applikationer endnu at blive opdaget.
Sammenfattende viste Tali Billed-Based cytometer her præsenterer en ny teknologi, der giver mulighed for samtidig visualisering og analyse af cellepopulationer, der muliggør vurdering af de enkelte celler samt CELl populationer i et kompakt format med en simpel arbejdsgang.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 |
Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 |
Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 |
Tali Viability Kit – Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 |
Tali Viability Kit – Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 |
Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 |
U2OS cells |