GFP अभिव्यक्ति और व्यवहार्यता ताली cytometer छवि के आधार का उपयोग का मूल्यांकन
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे सेल व्यवहार्यता और प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति assays ताली cytometer छवि के आधार का उपयोग कर प्रदर्शन करने के लिए.
Abstract
Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn’t allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn’t allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit – Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.
Protocol
Discussion
हम सिर्फ व्यवहार्यता का प्रदर्शन मायने रखता है और GFP अभिव्यक्ति का आकलन ताली – छवि के आधार cytometer का उपयोग करने के लिए एक प्रक्रिया को विस्तृत किया है. उसी प्रक्रिया का उपयोग करना, इस कोशिकामापी सहित अन्य assays के एक नंबर प्रदर्शन करने में सक्षम है: apoptosis आरएफपी, और सेल व्यवहार्यता गैर transduced कोशिकाओं का उपयोग विश्लेषण.
सेल व्यवहार्यता, जीन अभिव्यक्ति और apoptosis के Fluorometric assays में जैव चिकित्सा अनुसंधान 7-12 कुंजी तरीके बन गए हैं. अतीत, अलग इंस्ट्रूमेंटेशन में कोशिकाओं के बारे में मात्रात्मक और दृश्य सूचना प्राप्त इस्तेमाल किया गया है. जबकि एक विषम आबादी के भीतर कोशिकाओं के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रवाह cytometry के उपयोग के माध्यम से हुई, दृश्य या गुणात्मक जानकारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 1-4 के उपयोग के माध्यम से इकट्ठा किया गया. यहाँ, हम एक तकनीक है कि जनसंख्या और व्यक्तिगत सेल के अध्ययन के बीच की खाई को पुल उपस्थित थे. ताली छवि के आधार cytometer, मात्रात्मक दा का उपयोगटा और व्यक्तिगत कोशिकाओं या सेल आबादियों के बारे में दृश्य कक्ष डेटा एक साथ एकत्र किया जा सकता है. ताली साधन जीन की अभिव्यक्ति का आकलन, apoptosis assays, दवा की प्रभावकारिता का अध्ययन, और रोग प्रगति का आकलन सहित आवेदनों की एक श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
ताली छवि के आधार cytometer captures और उज्ज्वल क्षेत्र है, लाल प्रतिदीप्ति और हरे रंग प्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण करती है, कक्षों की subpopulations के बारे में जानकारी प्राप्त की जा करने के लिए अनुमति है. उदाहरण के लिए, इस परख में, हम GFP-व्यक्त सेल मृत सेल लाल डाई का उपयोग करते हुए जनसंख्या के भीतर जीवित कोशिकाओं से मृत कोशिकाओं भेद करने में सक्षम थे. यह व्यवहार्य कोशिकाओं व्यक्त GFP की माप सटीकता देता है, और बहाव के प्रसंस्करण के लिए useable कोशिकाओं की आबादी को पहचानती है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि जनसंख्या में मृत कोशिकाओं संस्कृति में सामान्य कोशिका मृत्यु या कोशिका मृत्यु की वजह से पर्यावरण की स्थिति (जैसे trypsinization, या सहित विभिन्न स्रोतों से उत्पन्न हो सकता हैअभिकर्मक / पारगमन चुना विधि द्वारा प्रेरित ATH).
यहाँ हम U2OS कोशिकाओं के साथ ताली कोशिकामापी का उपयोग प्रदर्शित करता है. इसी तरह के तरीकों सबसे स्तनधारी और कीट कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है है. प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए, ताली कोशिकामापी मात्रात्मक GFP अभिव्यक्ति डेटा, जो एक मानक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कोशिकाओं के एक दृश्य निरीक्षण के साथ संभव नहीं है का उत्पादन किया. हालांकि इन परिणामों प्रवाह cytometry करने के लिए तुलना कर रहे हैं, वे समय का एक अंश में एकत्र कर रहे हैं. कोशिकामापी सही व्यास में गिनती 60 सुक्ष्ममापी से 5 सुक्ष्ममापी के बीच कोशिकाओं के लिए सक्षम है, 1 x 10 5 1 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में आदर्श है.
यह महत्वपूर्ण है कि सबसे मानक मृत सेल लाल धुंधला प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित सहित धुंधला प्रोटोकॉल, बिंदु, propidium आयोडाइड का उपयोग करने के लिए रहते हैं और मृत कोशिकाओं को भेद. यह एक चुनौती प्रस्तुत करता है जब कोशिकाओं है कि सेंट के लिए किया गया permeabilized में व्यवहार्यता का आकलनमार्करों के intracellular aining, के बाद से PI एक समझौता झिल्ली के साथ किसी भी सेल दाग होगा. चूंकि किसी भी फ्लोरोसेंट रंजक या प्रोटीन है कि हरे या लाल प्रतिदीप्ति चैनल के साथ पता लगाया जा सकता है ताली cytometer छवि के आधार पर विश्लेषण किया जा सकता है, भविष्य के अध्ययन जैसे amine प्रतिक्रियाशील व्यवहार्यता रंजक चार वैकल्पिक रंगों के इस्तेमाल का पता लगाने सकता है. Perfetto एट अल द्वारा एक 2006 के अध्ययन 12. रहते हैं और मृत सेल आबादी भेदभाव में इन रंगों का उपयोग करने के लिए आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो पाया .
ध्यान दें कि ताली assays के प्रदर्शन कर सकते हैं के प्रकार के संबंध के साथ सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, के बाद से साधन के द्वारा प्रयोग किया जाता उद्देश्य 4X है, गिनती ऑपरेशन बड़ा प्रकार की कोशिकाओं के लिए सीमित कर रहे हैं: जैसे mitochondria या vesicles के उप सेलुलर संरचनाओं, और बैक्टीरियल कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता है. यह भी ध्यान रखें कि ताली में चैनलों का पता लगाने fluorophores कि उत्तेजित और चैनल के अंदर फेंकना करने के लिए सीमित कर रहे हैं. जबकि YFP और उज्ज्वल mCherry संकेतों गएक पता लगाया जा, dimmer mCherry संकेत नहीं कर सकते हैं. अंत में, ताली केवल निलंबन में कोशिकाओं का विश्लेषण करती है. यह सही किसी स्लाइड का पालन कोशिकाओं गिनती नहीं होगा. इसके अलावा, जबकि वहाँ कोशिकाओं है कि अनियमित आकार के हैं, कुछ खमीर और प्राथमिक कोशिकाओं सहित गिनती के लिए केवल सीमित क्षमता है.
इसके अलावा, भविष्य के अध्ययन की संभावना मार्करों के intracellular अभिव्यक्ति का आकलन करने में इस प्रणाली के उपयोग को संबोधित करेंगे. व्यक्तिगत रंजक आसन्न चैनलों के साथ वर्णक्रमीय ओवरलैप, Invitrogen ऑनलाइन SpectraViewer उपकरण (का उपयोग करने के लिए जाँच की जा सकती है / www.invitrogen.com spectraviewer). इस प्रौद्योगिकी के नयापन देखते हुए आवेदनों की पूरी रेंज अभी तक की खोज की जा.
सारांश में, यहाँ ताली cytometer छवि के आधार प्रदर्शन एक नई तकनीक है कि एक साथ और सेल आबादी के दृश्य विश्लेषण के लिए अनुमति देता है प्रस्तुत करता है, व्यक्ति की कोशिकाओं के मूल्यांकन के रूप में अच्छी तरह के रूप में सेल सक्षमएक सरल कार्यप्रवाह के साथ एक कॉम्पैक्ट प्रारूप में एल आबादी.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 |
| U2OS cells |
References
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