Detta protokoll beskriver hur du utför cellviabiliteten och fluorescens analyser uttryck med Tali bildbaserade flödescytometer.
Encelliga och befolkning information är ofta fås antingen med flödescytometri eller fluorescensmikroskopi. Men dessa två metoder ger olika information. Flödescytometri ger kvantitativa multi-parametrisk information om fysiska egenskaper och färgning eller uttryck, men inte tillåter visualisering. Fristående fluorescensmikroskopi ger visuell data, men inte tillåter enkla kvantitativa mätningar 1.
Bildbaserade Cytometry överbryggar gapet mellan dessa två metoder, vilket möjliggör snabb visualisering och samtidig kvantitativ analys av tusentals celler i heterogena populationer 2. Här presenterar vi en metod för att utföra cellviabiliteten och grönt fluorescerande protein (GFP) analyser uttryck med Tali bildbaserade flödescytometer 3. Den Tali instrumentet är en 3-kanals (ljust fält, grön fluorescens, röd fluorescens) bänk analys plattform som OffeRS flera fördelar jämfört med flödescytometri och fluorescensmikroskopi. Den Tali flödescytometer är billigare, tar mindre bänken utrymme, kräver mindre underhåll och arbetsflödet har förenklats så att drift och analys är mycket enklare och snabbare. Den Tali flödescytometer kan utföra en rad fjädring cellbaserade analyser, inklusive GFP och röda fluorescerande protein (RFP) uttryck, apoptos 4-6 och cellviabiliteten analys med propidiumjodid (PI) 7-11.
Här visar vi användning av Tali instrumentet att utföra en analys cellviabiliteten i celler som uttrycker GFP. GFP-transduced cellerna färgas med Tali livskraft Kit – Dead Cell Röd. Cellerna är sedan pipetteras till en Tali Mobil Analys Skjut och lastas in i cytometern. Ljusa fält, röd fluorescens och grön fluorescens bilder fångas upp och analyseras med hjälp av analys specifika algoritmer. Histogram är då skapas för att visa cellstorlek, PI fluorescence intensitet och GFP fluorescensintensiteten. Dessa parametrar kan sedan thresholded till hem på en specifik cell befolkning.
En sida-vid sida jämförelse av Tali bildbaserade flödescytometer och traditionella flödescytometri visar att de två metoderna ger jämförbara uppgifter om cellernas livskraft och protein uttryck. Ger dock Tali instrumentet ytterligare visuell information om den cell befolkningen som inte kan erhållas med hjälp av en flödescytometer.
Vi har precis detaljerat förfarande för att utföra livskraft räknas och bedöma GFP uttryck med Tali bildbaserade flödescytometer. Med samma förfarande, skall den cytometern kan utföra ett antal andra analyser, bland annat: apoptos, RFP och cellviabiliteten analys med hjälp av icke-transduced celler.
Fluorometriska analyser av cellviabiliteten, genuttryck och apoptos har blivit viktiga metoder inom biomedicinsk forskning 7-12. I det förflutna separata instrument har använts för att erhålla kvantitativa och visuell information om celler. Medan kvantitativ information om celler i en heterogen befolkning har samlat med hjälp av flödescytometri, har visuell eller kvalitativ information samlats in med hjälp av fluorescensmikroskopi 1-4. Här presenterar vi en teknologi som överbryggar klyftan mellan befolkningen och enskilda studier cell. Använda Tali bildbaserade cytometer, kvantitativa daTA och visuell datacell om enskilda celler eller populationer cell kan samlas samtidigt. Den Tali Instrumentet kan användas för en rad tillämpningar inklusive bedömning av genuttryck, analyser apoptos, studier av läkemedlets effektivitet, och bedömning av sjukdomsprogress.
Den Tali bildbaserade cytometern fångar och analyser ljusa fält, röd fluorescens och grön fluorescens bilder, vilket gör att information om subpopulationer av celler skall erhållas. Till exempel i denna analys, kunde vi urskilja döda celler från levande celler i GFP-uttryckande celler befolkningen som använder Dead Cell röd färg. Detta ger noggrannhet i mätningen av livskraftiga celler som uttrycker GFP, och identifierar befolkningen i cellerna användbar för vidareförädlingen. Det är viktigt att notera att döda celler i befolkningen kan uppstå från olika källor, inklusive normal celldöd i kultur eller celldöd orsakas av miljömässiga förhållanden (t ex trypsinization eller death induceras av det valda transfektion / transduktion metod).
Här kan vi demonstrera användningen av Tali cytometern med U2OS celler. Liknande metoder kan utföras med de flesta däggdjur och insektsceller. För varje cellinje producerade Tali cytometern kvantitativa data GFP uttryck, vilket inte är möjligt med en visuell kontroll av cellerna med en vanlig fluorescensmikroskop. Även om dessa resultat är jämförbara med flödescytometri, de samlas i en bråkdel av tiden. Cytometern är kapabel att exakt räkna celler mellan 5 ìm till 60 mikrometer i diameter, helst vid en koncentration på 1 x 10 5 till 1 x 10 7 celler / ml.
Det är viktigt att påpeka att de flesta vanliga fläckar protokoll, inklusive the Dead Cell Röda färgningsprotokollet beskrivs här, använd propidiumjodid att skilja levande och döda celler. Detta är en utmaning vid bedömningen av lönsamheten i celler som har permeabilized för Staining av intracellulära markörer, eftersom PI kommer fläcken någon cell med en komprometterad membran. Eftersom alla fluorescerande färg eller protein som kan detekteras med den gröna eller röda fluorescens kanaler kan analyseras på Tali bildbaserade cytometer kan framtida studier undersöka användningen av alternativa färgämnen, såsom amin reaktiva livskraft färgämnen 4. En undersökning från 2006 av Perfetto et al. 12 hittade dessa färgämnen för att vara enkel att använda och reproducerbar i diskriminera levande och döda cellpopulationer.
Observera att Tali har begränsningar vad gäller vilka typer av analyser kan utföra. Till exempel, eftersom målet används av instrumentet är 4X, räknar verksamheten begränsas till större celltyper: sub-cellulära strukturer såsom mitokondrier eller blåsor, och bakteriella celler kan inte kvantifieras. Observera också att upptäcka kanaler i Tali är begränsade till fluoroforer som exciterar och släpper inom kanaler. Medan YFP och ljus mCherry signaler Cen detekteras, dimmer mCherry signaler inte kan. Slutligen analyserar Tali enda celler i suspension. Det kommer inte att exakt räkna celler som ansluter sig till en bild. Samtidigt som det bara finns begränsade möjligheter för att räkna celler som oregelbundet formade, däribland en del jäst och primära celler.
Dessutom kommer framtida studier adress sannolikt att använda detta system för att bedöma uttryck av intracellulära markörer. Individuella färgämnen kan kontrolleras spektral överlappning med intilliggande kanaler, med hjälp av Invitrogen online SpectraViewer verktyg ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). Med tanke på det nya i denna teknik har det fulla spektrum av tillämpningar ännu inte upptäckt.
Sammanfattningsvis visade Tali bildbaserade cytometern presenterar här en ny teknik som möjliggör samtidig visualisering och analys av cellpopulationer, vilket gör att bedömningen av enskilda celler samt CELl populationer i ett kompakt format med ett enkelt arbetsflöde.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 |
Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 |
Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 |
Tali Viability Kit – Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 |
Tali Viability Kit – Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 |
Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 |
U2OS cells |