Modelli per MAME 4D Live-Imaging cellule di tumore: Interazioni microambiente che Impact progressione maligna
Summary
Abbiamo sviluppato modelli di co-coltura 3D per live-cell imaging in tempo reale delle interazioni tra cellule tumorali del seno e altre cellule nel loro microambiente che hanno un impatto progressione verso un fenotipo invasivo. Questi modelli possono servire come schermi preclinici di farmaci per colpire paracrino indotte proteolitici, percorsi chemochine / citochine e chinasi implicati nella invasività.
Abstract
Abbiamo sviluppato modelli di co-coltura 3D, che noi chiamiamo MAME (m ammary uno rchitecture e m icroenvironment MBIENTALE e), e li hanno usati per la live-cell imaging in tempo reale di interazione fra cellule. Il nostro obiettivo generale era quello di sviluppare modelli che ricapitolano l'architettura delle lesioni mammarie preinvasive di studiare la loro progressione verso un fenotipo invasivo. Specificamente, abbiamo sviluppato modelli per analizzare interazioni tra pre-maligne varianti cellule epiteliali mammarie e altri tipi di cellule del microambiente tumorale che sono stati implicati nel migliorare o ridurre la progressione delle cellule epiteliali mammarie preinvasive a invasive carcinomi duttali. Altri tipi cellulari studiati fino ad oggi sono cellule mioepiteliali, fibroblasti, macrofagi e sangue e le cellule endoteliali microvascolari linfatici. Oltre ai modelli MAME, che sono progettati per ricapitolare le interazioni cellulari all'interno del seno duranteprogressione tumorale, abbiamo sviluppato modelli paragonabili per la progressione dei tumori della prostata.
Qui si illustrano le procedure per la definizione delle co-colture 3D insieme con l'uso di live-cellula imaging e un saggio funzionale proteolisi per seguire la transizione di co-colture di carcinoma mammario duttale in situ (DCIS) cellule e fibroblasti ad un fenotipo invasivo nel tempo, in questo caso più di venti-tre giorni di coltura. Il co-colture MAME costituiti da strati multipli. I fibroblasti sono incorporati nello strato di fondo di collagene di tipo I. Su che si trova uno strato di membrana basale ricostituita (meccanismi) su cui sono seminate cellule DCIS. Uno strato finale del 2% MLF è incluso e rifornito ad ogni cambio di media. Per proteolisi immagine associata con la progressione di un fenotipo invasivo, usiamo proteine fluorescenti colorante-temprate (DQ) della matrice (DQ-collagene I mescolato con lo strato di collagene I e DQ-collagene IV miscelato con lo strato intermedio di rBM) e osservare colture vive usando la microscopia confocale. Sezioni ottiche vengono acquisiti, elaborati e ricostruita in 3D con il software di visualizzazione Volocity. Nel corso di 23 giorni in co-colture MAME, le cellule proliferano DCIS e fondersi in grandi strutture invasive. I fibroblasti migrano e venire incorporato in queste strutture invasive. Fluorescenti frammenti proteolitici dei collageni si trovano in associazione con la superficie di strutture DCIS, intracellulare, e anche disperse in tutta la matrice circostante. Farmaci che percorsi proteolitica bersaglio, chemochine / citochine e chinasi o modifiche nella composizione del co-colture cellulari può ridurre l'invasività, suggerendo che i modelli MAME possono essere utilizzati come schermi preclinico per nuovi approcci terapeutici.
Protocol
Discussion
Come dimostrato, la co-colture MAME può essere utilizzato per live-cella di imaging in tempo reale delle interazioni tra i vari costituenti cellulari che compongono un tumore del seno ed il suo microambiente. In studi in corso nel nostro laboratorio, abbiamo usato co-colture MAME quello di individuare percorsi proteolitici associati con la transizione da carcinoma duttale in situ di carcinoma duttale invasivo, nonché le interazioni tra i sentieri e percorsi proteolitici coinvolti in questa transizione, come chemochine…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato, in parte, dal National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS e RRM). Live-cell di imaging è stata effettuata nel Nucleo Microscopia, Imaging e Citometria Risorse sostenuta, in parte, NIH Centro concessione P30 CA22453 il Karmanos Cancer Institute, Wayne State University e dal Perinatologia Research Branch del National Institute of Child Health e Sviluppo , Wayne State University.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) |
Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-col IV D12052 |
|
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific Co. | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza | MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 |
Phenol red–free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
References
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
