La Ex vivo Préparation isolé microvaisseaux squelettique pour les enquêtes de la réactivité vasculaire

Summary

Un Ex vivo Préparation est décrite pour l'isolement des artérioles plus gracilis résistance musculaire pour interrogatoire des deux réponses à des stimuli vasoactifs vasculaires et l'évaluation des propriétés structurales par le biais de base mécanique murales passives.

Abstract

La préparation des microvaisseaux isolé est une préparation ex vivo qui permet à l'examen des différentes contributions de facteurs qui diamètre du vaisseau de contrôle, et donc, ^1-5 résistance perfusion. Il s'agit d'une préparation classique expérimental qui a été, dans une large mesure, initialement décrit par Uchida et al. ^{De 15} il ya plusieurs décennies. Cette description initiale a fourni la base pour les techniques qui a été largement modifié et amélioré, principalement dans le laboratoire du Dr Brian Duling à l'Université de Virginie ^6-8, et nous présentons une approche actuelle dans les pages suivantes. Cette préparation sera spécifiquement référence à l'artériole gracilis dans un rat comme des microvaisseaux de choix, mais la préparation de base peut être facilement appliqué aux navires isolés à partir de presque n'importe quel autre tissu ou organe à travers les espèces ^9-13. Mécaniques (c.-à-dimensionnelle) des changements dans l'isolé microvaisseaux peuvent facilement être évaluéen réponse à un large éventail de paramètres physiologiques (par exemple, l'hypoxie, la pression intravasculaire, ou de cisaillement) ou défis pharmacologiques, et peut donner un aperçu des éléments mécaniques comprenant des réponses intégrées dans une intacte, bien que ex vivo, des tissus. L'importance de cette méthode est qu'elle permet la manipulation facile des influences sur la régulation intégrée de diamètre des microvaisseaux, tout en permettant aussi le contrôle de la plupart des contributions provenant d'autres sources, y compris la pression intravasculaire (myogène), l'innervation autonome, hémodynamique ( par exemple, la contrainte de cisaillement), les stimuli endothéliales dépendante ou indépendante, hormonaux, et les influences du parenchyme, afin de fournir une liste partielle. Sous des conditions appropriées expérimentales et avec des objectifs appropriés, ce qui peut servir comme un avantage par rapport in vivo ou in situ des tissus / organes des préparations, qui ne permettent pas facilement pour le contrôle facile de variables systémiques plus larges.

La malimitation jor de cette préparation est essentiellement la conséquence de ses points forts. Par définition, le comportement de ces navires est à l'étude dans des conditions où la plupart des plus importants contributeurs à la régulation de la résistance vasculaire ont été supprimés, y compris de neurones, humorale, métabolique, etc En tant que tel, l'enquêteur est mis en garde pour éviter de trop- l'interprétation et l'extrapolation des données qui sont recueillies en utilisant cette préparation. L'autre domaine de préoccupation significatif à l'égard de cette préparation est qu'il peut être très facile d'endommager les composants cellulaires tels que la paroi endothéliale ou le muscle lisse vasculaire, de telle sorte que des variables source d'erreur peut être introduit. Il est fortement recommandé que l'investigateur individuel d'utiliser des mesures appropriées pour assurer la qualité de la préparation, à la fois au début de l'expérience et périodiquement tout au long d'un protocole.

Protocol

1. Avant l'expérience

1. Avant le jour l'expérience, des tubes de verre capillaires des dimensions appropriées pour la station sont tiré dans micropipettes (soit un extracteur horizontal ou vertical peut être utilisé). Le diamètre de la pointe peut être facilement ajustée en fonction de la cuve étant isolé, même si nous utilisons généralement une plage de diamètres entre 50-150 um. Ces derniers sont ensuite pliés à la configuration appropriée pour le chauffage suivant station de microvaisseaux au cours d'une flamme de butane. Conseils micropipettes sont physiquement cassé pour le diamètre approximatif (avec des pinces fines) pour la microvaisseaux en question....

Discussion

Le protocole présenté décrit la canulation isolement, le retrait et double d'un microvaisseaux du muscle squelettique, bien que cette technique générale peut être facilement appliquée à la plupart des tissus. Pour le manuscrit en cours, le terme «artériole" a été utilisé par les auteurs pour décrire un navire de résistance comprise entre 70-120 m de diamètre sous tonalité actif de repos, ce qui est également un contributeur majeur à la régulation de la résistance de perfusion à un organe ou tissus.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactifs et appareillage	Entreprise	Commentaires / Catalogue #
Chambre des navires	Coutume	Dave Eick (MCW)
Bain d'eau chauffée de circulation	PolyScience et Haake	Haake DC 10
Pipettes	Frédéric Haer & Co.	Capillaire Tube 2,0 mm x 1,0 mm OD ID (27-33-1)
Le moniteur de pression	Instruments de précision du monde
Réservoir d'eau chemisé	Coutume
Source de lumière externe	Instruments de précision du monde	Novaflex
Extracteur Pipet	Microdonnées à grande diffusion Instruments	PMP102 micropipette Puller
Achèvement completment d'outils chirurgicaux	Outils belle science	Dumont
Ultra fines pinces	Outils belle science	Inox n ° 5
Fil de suture en soie	Ethilon	# 10-0 ou 9-0
Microscope stéréo	Olympe	Olympus SZ-11
Étriers vidéo analogiques	Boeckeler	Via contrôleur (Via-100)
Caméra haute résolution analogique	Panasonic	GP-602 MF
Ballon d'oxygène	Régional	Bilan de l'azote de 21% et 5% de CO 2 d'azote équilibre
Tubes	Tygon
Vider la pompe	Cole Parmer Instrument Co.
PSS Rat modifiés	Voir la recette ci-dessous
PSS relaxants van Breemen de	Voir la recette ci-dessous

Mise à jour PSS Recette Rat	Pour faire deux litres de PSS	20X Stock Sel (2L)	20X stock régulateur (2L)
NaCl		278,0 g
KCl		14,0 g
MgSO 4 .7 H 2 O-		11,5 g
CaCl 2-H 2 O		9,4 g
NaHCO 3			80,8 g
EDTA			0,4 g
NaH 2 PO 4	0,28 g
Glucose	1,98 g
20x stock de sel	100 ml
20x stock régulateur	100 ml
Eau distillée	1800 ml

PSS relaxants van Breemen de	Pour faire 2 litres de PSS	20X Stock sel (1L)	20X stock régulateur (1L)
NaCl		107,4 g
KCl		7,0 g
MgSO 4 .7 H 2 O-		5,76 g
MgCl 2-6H 2 O		81,32 g
NaHCO 3			40,4 g
HAEUne			0,2 g
EGTA			15,22
NaH 2 PO 4	0,28 g
Glucose	1,98 g
20x stock de sel	100 ml
20x stock régulateur	100 ml
Eau distillée	1800 ml