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Immunologie et infection

La détection des toxines translocation dans le cytosol hôte par résonance plasmonique de surface

Published: January 03, 2012
doi:
10.3791/3686
, , ,
1Department of Molecular Biology and Microbiology,University of Central Florida

Summary

Dans ce rapport, nous décrivons comment résonance plasmonique de surface est utilisé pour détecter l'entrée de toxine dans le cytosol hôte. Cette méthode très sensible peuvent fournir des données quantitatives sur la quantité de toxine cytosolique, et elle peut être appliquée à une gamme de toxines.

Abstract

Toxines AB se composent d'un sous-unité enzymatique Un cellulaire et d'une sous-contraignante B 1. Ces toxines sont sécrétées dans le milieu extracellulaire, mais ils agissent sur des cibles dans le cytosol des eucaryotes. Certains voyages AB toxines par les transporteurs vésiculaires de la surface cellulaire vers le réticulum endoplasmique (RE) avant d'entrer dans le cytosol 2-4. Dans l'urgence, le dissocie catalytique Une chaîne du reste de la toxine et se déplace à travers un canal protéique-conducteurs pour atteindre sa cible cytosolique 5. La translocation, cytosolique Une chaîne est difficile à détecter car le trafic de toxine à l'ER est un processus extrêmement inefficace: la toxine la plus intériorisé est acheminé vers les lysosomes de dégradation, alors seulement une petite fraction de la surface de la toxine liée atteint l'appareil de Golgi et ER 6 -12.

Pour surveiller la translocation de la toxine de ER dans le cytosol des cellules en culture, nous avons combiné un protocole avec le fractionnement subcellulaire highlméthode de détection sensible y résonance plasmonique de surface (SPR) 13-15. La membrane plasmique des cellules traitées toxine est sélectivement perméabilisées à la digitonine, permettant la collecte d'une fraction cytosolique qui est ensuite perfusé au cours d'un capteur SPR recouvert d'une anti-toxine un anticorps à chaîne. Le capteur revêtues d'anticorps peut capturer et détecter pg / mL quantités de toxines cytosolique. Avec ce protocole, il est possible de suivre la cinétique d'entrée de toxine dans le cytosol et de caractériser des effets inhibiteurs sur l'événement de translocation. La concentration de la toxine cytosolique peut également être calculé à partir d'une courbe standard générée avec des quantités connues d'une chaîne de normes qui ont été perfusés sur le capteur. Notre méthode représente un système rapide de détection sensible et quantitative qui ne nécessite pas de radiomarquage ou d'autres modifications à la toxine cible.

Protocol

1. Préparation de la digitonine Ajouter 500 ul d'éthanol à 100% à un microtube et le placer dans un bloc thermique fixée à 80 ° C pendant 10 min. Dissoudre 2,5 mg de digitonine dans 250 uL d'éthanol chauffé pour produire une solution stock de 1% de digitonine. Pour générer une solution de travail de digitonine 0,04%, ajouter 40 ul de la solution stock à 960 uL digitonine de HCN tampon (50 mM Hepes pH 7,5, NaCl 150 mM, 2 mM de CaCl2, 10 mM de N-éthylmaléimid…

Discussion

Comparaison à la méthodologie existante

Notre test de translocation SPR à base représente une méthode rapide, sensible, et quantitatives pour détecter administration de la toxine dans le cytosol hôte. La technique ne nécessite pas de radiomarquage ou d'autres modifications à la toxine, et il peut être appliqué à toute toxine pour lequel un anti-toxine A anticorps à chaîne est disponible. Les méthodes existantes pour surveiller le passage de toxines dans le cytosol se fondent…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par NIH R01 AI073783 à K. Teter. Nous remercions le Dr Shane Massey pour l'aide au développement de l'fractionnement subcellulaire protocole et Helen Burress pour la lecture critique du manuscrit.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Digitonin Sigma D141
Ethanol Acros 61509-0010
DMEM Invitrogen 11995065
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Ganglioside GM1 Sigma G7641
CTA Sigma C2398
PTS1 List 182
NHS (N-Hydroxysuccinimide) Pierce 24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) Thermo Scientific 22981
Ethanolamine Sigma E0135
PBST Medicago 09-8903-100
Anti-CTA antibody Santa Cruz Biotech sc-80747
Anti-CTB antibody Calbiochem 227040
Anti-PTS1 antibody Santa Cruz Biotech sc-57639
Refractometer Reichert SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides Reichert 13206060
Syringe pump Cole Palmer 780200C
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Citer Cet Article
Taylor, M., Banerjee, T., VanBennekom, N., Teter, K. Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (59), e3686, doi:10.3791/3686 (2012).
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