Nachweis von Toxin Translokation in den Host-Cytosol von Surface Plasmon Resonance

Summary

In diesem Bericht beschreiben wir, wie Oberflächen-Plasmon-Resonanz verwendet wird, um Toxin Einreise in den Aufnahmemitgliedstaat Zytosol zu erkennen. Dieser hochempfindliche Methode lassen sich quantitative Daten über die Höhe der zytosolischen Toxin geben, und es kann zu einer Reihe von Toxinen eingesetzt werden.

Abstract

AB Toxine bestehen aus einer enzymatischen A-Untereinheit und einer Zell-bindenden B-Untereinheit ^1. Diese Toxine sind in das extrazelluläre Milieu ausgeschieden, aber sie wirken auf Ziele innerhalb der eukaryotischen Cytosol. Einige AB Toxine Reise durch Vesikel Träger von der Zelloberfläche zum Endoplasmatischen Retikulum (ER) vor dem Eintritt in das Zytosol ^2-4. In der Notaufnahme, um die katalytische A-Kette distanziert sich von dem Rest des Toxins und bewegt sich durch ein Protein-leitenden Kanals erreichen ihren zytosolischen Ziel ^5. Die transloziert, cytosolische Eine Kette ist nur schwer zu erkennen, weil Toxin Menschenhandel, die ER ist ein sehr ineffizienter Prozess: Die meisten verinnerlicht Toxin wird zu den Lysosomen zum Abbau geführt, so dass nur ein kleiner Bruchteil der Oberflächen-gebundenen Toxin gelangt der Golgi-Apparat und ER ^{6 -12.}

Zur Überwachung Toxin Translokation aus dem ER ins Zytosol in kultivierten Zellen, kombinierten wir eine subzelluläre Fraktionierung-Protokoll mit den highly empfindliche Nachweismethode der Surface Plasmon Resonance (SPR) ^13-15. Die Plasmamembran der Toxin-behandelten Zellen selektiv mit Digitonin permeabilisiert, wodurch Sammlung eines zytosolischen Fraktion, die anschließend über einen SPR-Sensor mit einer Anti-Toxin A-Antikörper beschichtet ist, perfundiert. Die Antikörper-beschichteten Sensor kann erfassen und erkennen pg / mL Mengen von zytosolischen Toxin. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die Kinetik der Toxin-Eintrag in das Zytosol zu folgen und hemmende Wirkung auf die Translokation Ereignis zu charakterisieren. Die Konzentration der zytosolischen Toxin kann auch aus einer Standardkurve mit bekannten Mengen von A-Kette Standards, die über den Sensor wurden perfundiert, festgesetzt werden. Unsere Methode stellt eine schnelle, empfindliche und quantitative Nachweis-System, das keine radioaktiven Markierung oder andere Änderungen an der Ziel-Toxin.

Protocol

1. Vorbereitung der Digitonin Add 500 mL 100% Ethanol zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie in einem Heizblock bei 80 ° C für 10 min eingestellt. Lösen von 2,5 mg Digitonin in 250 ul der beheizten Ethanol bis zu einer 1% Stammlösung von Digitonin zu produzieren. So generieren Sie eine funktionierende Lösung von 0,04% Digitonin, dann werden 40 ul der Digitonin-Stammlösung zu 960 ul der HCN-Puffer (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-Ethylmal…

Discussion

Vergleich zu bestehenden Methoden

Unsere SPR-basierter Assay Translokation stellt eine schnelle, empfindliche und quantitative Methode zur Toxin Lieferung in die Host-Cytosol zu erkennen. Die Technik erfordert keine radioaktiven Markierung oder sonstige Änderungen, um das Toxin, und es kann auf jeden Toxin, für die eine anti-Toxin A-Antikörper zur Verfügung angewendet werden. Bestehende Methoden zur Toxin Passage in das Zytosol Monitor beruhen auch auf eine subzelluläre Fraktionierung Pro…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Digitonin	Sigma	D141
Ethanol	Acros	61509-0010
DMEM	Invitrogen	11995065
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
Ganglioside GM1	Sigma	G7641
CTA	Sigma	C2398
PTS1	List	182
NHS (N-Hydroxysuccinimide)	Pierce	24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)	Thermo Scientific	22981
Ethanolamine	Sigma	E0135
PBST	Medicago	09-8903-100
Anti-CTA antibody	Santa Cruz Biotech	sc-80747
Anti-CTB antibody	Calbiochem	227040
Anti-PTS1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-57639
Refractometer	Reichert	SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides	Reichert	13206060
Syringe pump	Cole Palmer	780200C