Dans ce rapport, nous décrivons comment résonance plasmonique de surface est utilisé pour détecter l'entrée de toxine dans le cytosol hôte. Cette méthode très sensible peuvent fournir des données quantitatives sur la quantité de toxine cytosolique, et elle peut être appliquée à une gamme de toxines.
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Article de méthode
La détection des toxines translocation dans le cytosol hôte par résonance plasmonique de surface
Dans cet article
Résumé
Résumé
Toxines AB se composent d'un sous-unité enzymatique Un cellulaire et d'une sous-contraignante B 1. Ces toxines sont sécrétées dans le milieu extracellulaire, mais ils agissent sur des cibles dans le cytosol des eucaryotes. Certains voyages AB toxines par les transporteurs vésiculaires de la surface cellulaire vers le réticulum endoplasmique (RE) avant d'entrer dans le cytosol 2-4. Dans l'urgence, le dissocie catalytique Une chaîne du reste de la toxine et se déplace à travers un canal protéique-conducteurs pour atteindre sa cible cytosolique 5. La translocation, cytosolique Une chaîne est difficile à détecter car le trafic de toxine à l'ER est un processus extrêmement inefficace: la toxine la plus intériorisé est acheminé vers les lysosomes de dégradation, alors seulement une petite fraction de la surface de la toxine liée atteint l'appareil de Golgi et ER 6 -12.
Pour surveiller la translocation de la toxine de ER dans le cytosol des cellules en culture, nous avons combiné un protocole avec le fractionnement subcellulaire highlméthode de détection sensible y résonance plasmonique de surface (SPR) 13-15. La membrane plasmique des cellules traitées toxine est sélectivement perméabilisées à la digitonine, permettant la collecte d'une fraction cytosolique qui est ensuite perfusé au cours d'un capteur SPR recouvert d'une anti-toxine un anticorps à chaîne. Le capteur revêtues d'anticorps peut capturer et détecter pg / mL quantités de toxines cytosolique. Avec ce protocole, il est possible de suivre la cinétique d'entrée de toxine dans le cytosol et de caractériser des effets inhibiteurs sur l'événement de translocation. La concentration de la toxine cytosolique peut également être calculé à partir d'une courbe standard générée avec des quantités connues d'une chaîne de normes qui ont été perfusés sur le capteur. Notre méthode représente un système rapide de détection sensible et quantitative qui ne nécessite pas de radiomarquage ou d'autres modifications à la toxine cible.
Protocole
1. Préparation de la digitonine
- Ajouter 500 ul d'éthanol à 100% à un microtube et le placer dans un bloc thermique fixée à 80 ° C pendant 10 min.
- Dissoudre 2,5 mg de digitonine dans 250 uL d'éthanol chauffé pour produire une solution stock de 1% de digitonine.
- Pour générer une solution de travail de digitonine 0,04%, ajouter 40 ul de la solution stock à 960 uL digitonine de HCN tampon (50 mM Hepes pH 7,5, NaCl 150 mM, 2 mM de CaCl2, 10 mM de N-éthylmaléimide, et un inhibiteur de protéase cocktail).
2. L'intoxication cellulaire et de perméabilisation
Not....
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Discussion
Comparaison à la méthodologie existante
Notre test de translocation SPR à base représente une méthode rapide, sensible, et quantitatives pour détecter administration de la toxine dans le cytosol hôte. La technique ne nécessite pas de radiomarquage ou d'autres modifications à la toxine, et il peut être appliqué à toute toxine pour lequel un anti-toxine A anticorps à chaîne est disponible. Les méthodes existantes pour surveiller le passage de toxines dans le cytosol se fondent également sur .......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Ce travail a été financé par NIH R01 AI073783 à K. Teter. Nous remercions le Dr Shane Massey pour l'aide au développement de l'fractionnement subcellulaire protocole et Helen Burress pour la lecture critique du manuscrit.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | |
| Digitonine | Sigma | D141 | |
| Éthanol | Acros | 61509-0010 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995065 | |
| Sérum de veau fœtal | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| GM1 | Sigma | G7641 | |
| CTA | Sigma | C2398 | |
| PTS1 | Liste | 182 | |
| NHS (N-hydroxysuccinimide) | Pierce | 24500 | |
| EDC (1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide) | Thermo Scientific | 22981 | |
| L'éthanolamine | Sigma | E0135 | |
| PBST | Medicago | 09-8903-100 | |
| Anti-CTA d'anticorps | Santa Cruz Biotech | sc-80747 | |
| D'anticorps anti-CTB | Calbiochem | 227040 | |
| Anti-PTS1 d'anticorps | Santa Cruz Biotech | sc-57639 | |
| Réfractomètre | Reichert | SR7000, SR7000DC | |
| SPR capteur de diapositives | Reichert | 13206060 | |
| Pompe à seringue | Cole Palmer | 780200C |
Références
- Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 1-24 (2002).
- Watson, P., Spooner, R. A. Toxin entry and trafficking in mammalian cells. Adv. Drug Deliv. Rev. 58, 1581-1596 (2006).
- Carbonetti, N. H.
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Réimpressions et autorisations
