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Immunologie et infection

सतह plasmon अनुनाद द्वारा विष स्थानान्तरण के होस्ट cytosol में जांच

Published: January 03, 2012
doi:
10.3791/3686
, , ,
1Department of Molecular Biology and Microbiology,University of Central Florida

Summary

इस रिपोर्ट में, हम का वर्णन कैसे सतह plasmon अनुनाद मेजबान cytosol में विष प्रविष्टि का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह बेहद संवेदनशील विधि साइटोसोलिक विष की मात्रा पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करते हैं, कर सकते हैं और यह विषाक्त पदार्थों की एक श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है.

Abstract

अटल बिहारी विषाक्त पदार्थों सबयूनिट enzymatic और एक सेल बाध्यकारी बी 1 सबयूनिट से मिलकर बनता है. इन विषाक्त पदार्थों को बाह्य परिवेश में secreted रहे हैं, लेकिन वे यूकेरियोटिक cytosol के भीतर लक्ष्य पर कार्य करते हैं. पुटिका वाहक कोशिका की सतह से 2-4 cytosol में प्रवेश करने से पहले endoplasmic जालिका (ईआर) द्वारा कुछ अटल बिहारी विषाक्त पदार्थों यात्रा. ईआर में, विष और चाल के बाकी हिस्सों से एक प्रोटीन का आयोजन चैनल के माध्यम से उत्प्रेरक एक श्रृंखला dissociates अपने साइटोसोलिक 5 लक्ष्य तक पहुँचने के लिए. translocated, साइटोसोलिक एक श्रृंखला का पता लगाने के लिए के लिए मुश्किल है क्योंकि विष ईआर के लिए तस्करी के एक बेहद अक्षम प्रक्रिया है: सबसे भली भाँति विष गिरावट के लिए lysosomes कराई है, तो केवल सतह बाध्य विष का एक छोटा सा अंश Golgi उपकरण और ईआर 6 तक पहुँचता है -12.

विष ईआर से संवर्धित कोशिकाओं में cytosol स्थानान्तरण की निगरानी करने के लिए, हम highl के साथ एक subcellular fractionation प्रोटोकॉल संयुक्तy सतह plasmon (SPR) प्रतिध्वनि 13-15 के संवेदनशील पता लगाने विधि. विष का इलाज कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली चुनिंदा digitonin साथ permeabilized है, जो बाद में एक SPR एक विरोधी विष एक श्रृंखला एंटीबॉडी के साथ लेपित सेंसर पर perfused है साइटोसोलिक अंश के संग्रह की अनुमति है. एंटीबॉडी – लेपित संवेदक पर कब्जा और साइटोसोलिक विष की स्नातकोत्तर / एमएल मात्रा का पता लगा सकते हैं. इस प्रोटोकॉल के साथ, यह संभव है cytosol में विष प्रविष्टि के कैनेटीक्स का पालन करें और स्थानान्तरण घटना पर निरोधात्मक प्रभाव विशेषताएँ है. साइटोसोलिक विष की एकाग्रता भी एक मानक है कि सेंसर के साथ perfused है एक श्रृंखला मानकों की ज्ञात मात्रा के साथ उत्पन्न वक्र से गणना की जा सकता है. हमारी विधि एक तेजी से, संवेदनशील और मात्रात्मक का पता लगाने प्रणाली है कि radiolabeling या लक्ष्य विष अन्य संशोधनों की आवश्यकता नहीं है का प्रतिनिधित्व करता है.

Protocol

1. Digitonin की तैयारी एक microcentrifuge ट्यूब 100% इथेनॉल 500 μL जोड़ें और यह एक गर्मी 80 डिग्री 10 मिनट के लिए सी सेट ब्लॉक में जगह. गर्म इथेनॉल 250 μL में digitonin के 2.5 मिलीग्राम भंग करने के लिए एक 1% digitonin का जायजा समाधान का उत्पादन…

Discussion

मौजूदा पद्धति के लिए तुलना करें

हमारे स्थानान्तरण SPR आधारित परख एक तेजी से, संवेदनशील और मात्रात्मक विधि मेजबान cytosol में विष प्रसव का पता लगाने का प्रतिनिधित्व करता है. तकनीक radiolabeling या विष को अन्…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम NIH अनुदान AI073783 R01 लालकृष्ण Teter के लिए वित्त पोषित किया गया था. हम सहायता के लिए पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए subcellular fractionation प्रोटोकॉल और हेलेन Burress के विकास में डा. शेन Massey धन्यवाद.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Digitonin Sigma D141
Ethanol Acros 61509-0010
DMEM Invitrogen 11995065
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Ganglioside GM1 Sigma G7641
CTA Sigma C2398
PTS1 List 182
NHS (N-Hydroxysuccinimide) Pierce 24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) Thermo Scientific 22981
Ethanolamine Sigma E0135
PBST Medicago 09-8903-100
Anti-CTA antibody Santa Cruz Biotech sc-80747
Anti-CTB antibody Calbiochem 227040
Anti-PTS1 antibody Santa Cruz Biotech sc-57639
Refractometer Reichert SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides Reichert 13206060
Syringe pump Cole Palmer 780200C
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Citer Cet Article
Taylor, M., Banerjee, T., VanBennekom, N., Teter, K. Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (59), e3686, doi:10.3791/3686 (2012).
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