Rilevamento di Traslocazione tossina nel citosol Host Surface Plasmon Resonance

Summary

In questo rapporto, descriviamo come risonanza plasmonica di superficie viene utilizzato per rilevare ingresso tossina nel citosol ospitante. Questo metodo molto sensibile in grado di fornire dati quantitativi sulla quantità di tossina citosolica, e può essere applicata ad una gamma di tossine.

Abstract

Tossine AB consistono in un subunità enzimatica A e una cellula vincolante subunità B ^1. Queste tossine vengono secreti nel milieu extracellulare, ma agiscono su bersagli all'interno del citoplasma degli eucarioti. Alcuni viaggi AB tossine da parte dei vettori delle vescicole dalla superficie cellulare verso il reticolo endoplasmatico (ER) prima di entrare nel citosol ^2-4. Al pronto soccorso, la dissocia catalitico Una catena dal resto della tossina e si muove attraverso una proteina conduttore canale per raggiungere il suo obiettivo citosolico ^5. Il traslocato, citosolica Una catena è difficile da rilevare perché il traffico di tossina al pronto soccorso è un processo estremamente inefficiente: la tossina più interiorizzato viene indirizzato ai lisosomi per la degradazione, in modo che solo una piccola frazione di superficie è legato tossina raggiunge l'apparato di Golgi e ER ^{6 -12.}

Per monitorare traslocazione di tossine dal ER al citosol in cellule in coltura, abbiamo combinato un protocollo con il frazionamento subcellulare highly metodo di rilevazione sensibile di risonanza di plasmoni superficiali (SPR) ^13-15. La membrana plasmatica delle cellule trattate con tossina è selettivamente permeabilizzate con digitonina, permettendo la raccolta di una frazione citosolica che viene successivamente perfuso su un sensore SPR rivestito con un anti-tossina A anticorpi a catena. L'anticorpo-rivestito sensore in grado di catturare e rilevare pg / mL quantità di tossina citosolico. Con questo protocollo, è possibile seguire la cinetica di entrata tossina nel citosol e caratterizzare effetti inibitori sulla manifestazione traslocazione. La concentrazione della tossina citosolica può anche essere calcolato da una curva standard generata con quantità note di una catena che gli standard sono stati irrorati sul sensore. Il nostro metodo rappresenta un rapido, sistema di rilevamento sensibile e quantitativa che non richiede radiomarcatura o altre modifiche alla tossina di destinazione.

Protocol

1. Preparazione del digitonina Aggiungere 500 ml di etanolo al 100% di una provetta e collocarla in un blocco di calore a 80 ° C per 10 min. Sciogliere 2,5 mg di digitonina in 250 ml di etanolo riscaldato per produrre una soluzione madre 1% del digitonina. Per generare una soluzione di lavoro del 0,04% digitonina, aggiungere 40 ml di soluzione di riserva digitonina a 960 ml di HCN tampone (50 Hepes mM pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-ethylmaleimide, e un inibitore dell…

Discussion

Confronto con metodologia esistente

Il nostro SPR-saggio basato su traslocazione rappresenta un metodo rapido, sensibile e quantitativa per rilevare la consegna tossina nel citosol ospitante. La tecnica non richiede radiomarcatura o altre modifiche alla tossina, e può essere applicato a qualsiasi tossina per i quali un anti-tossina A anticorpi catena è disponibile. Gli attuali metodi di monitorare il passaggio della tossina nel citosol anche contare su un protocollo di frazionamento subcellu…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Digitonin	Sigma	D141
Ethanol	Acros	61509-0010
DMEM	Invitrogen	11995065
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
Ganglioside GM1	Sigma	G7641
CTA	Sigma	C2398
PTS1	List	182
NHS (N-Hydroxysuccinimide)	Pierce	24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)	Thermo Scientific	22981
Ethanolamine	Sigma	E0135
PBST	Medicago	09-8903-100
Anti-CTA antibody	Santa Cruz Biotech	sc-80747
Anti-CTB antibody	Calbiochem	227040
Anti-PTS1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-57639
Refractometer	Reichert	SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides	Reichert	13206060
Syringe pump	Cole Palmer	780200C