La detección de la translocación de la toxina en el citosol de host de resonancia de plasmones superficiales

Summary

En este informe, se describe cómo resonancia de plasmones superficiales se utiliza para detectar la entrada de toxinas en el citosol de acogida. Este método altamente sensible puede proporcionar datos cuantitativos sobre la cantidad de toxina citosólica, y puede ser aplicado a una serie de toxinas.

Abstract

Toxinas AB consisten en una subunidad enzimática y una subunidad de unión celular B ^1. Estas toxinas son secretadas en el medio extracelular, sino que actúan sobre los objetivos en el citosol eucariota. Algunas toxinas AB viaje por las compañías de vesículas en la superficie celular en el retículo endoplásmico (RE) antes de entrar en el citosol ^2-4. En la sala de emergencias, el catalizador se disocia una cadena del resto de la toxina y se mueve a través de un canal proteico-llevar a cabo para alcanzar su objetivo citosólico ^5. La translocación, citosólica Una cadena es difícil de detectar porque el tráfico de la toxina a la sala de emergencia es un proceso extremadamente ineficiente: la toxina más interiorizado se dirige a los lisosomas para la degradación, por lo que sólo una pequeña fracción de la superficie con destino toxina alcanza el aparato de Golgi y RE ^{6 -12.}

Para controlar la translocación de la toxina de la sala de emergencias para el citosol de las células en cultivo, se combinó un protocolo de fraccionamiento subcelular con los highly método de detección sensible de resonancia de plasmones superficiales (SPR) ^13-15. La membrana plasmática de las células de toxinas es tratada de forma selectiva permeabilizadas con digitonina, logrando la recolección de una fracción citosólica, que posteriormente se perfunde en un sensor de SPR recubierto con una toxina anti-un anticuerpo de cadena. El sensor recubiertas de anticuerpos puede capturar y detectar pg / mL cantidades de la toxina del citosol. Con este protocolo, es posible seguir la cinética de entrada de la toxina en el citosol y caracterizar los efectos inhibitorios en el caso de desplazamiento. La concentración citosólica de la toxina también puede ser calculada a partir de una curva estándar generada con cantidades conocidas de una cadena de normas que han sido perfundidos sobre el sensor. Nuestro método consiste en un sistema rápido, detección sensible, cuantitativa y que no requiere marcaje radiactivo u otras modificaciones a la toxina de destino.

Protocol

1. Preparación de digitonina Añadir 500 l de etanol al 100% a un tubo de microcentrífuga y lo coloca en un bloque de calor fijado en 80 ° C durante 10 min. Disolver 2,5 mg de digitonina en 250 l de etanol se calienta para producir una solución de reserva del 1% de digitonina. Para generar una solución de trabajo de 0,04% digitonina, agregar 40 ml de la solución madre digitonina a 960 L de HCN buffer (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM de N-ethylmaleimide,…

Discussion

Comparación con la metodología vigente

Nuestra SPR-ensayo basado en la translocación representa un método rápido, sensible y cuantitativo para detectar la entrega toxina en el citosol de acogida. La técnica no requiere marcaje radiactivo u otras modificaciones a la toxina, y puede ser aplicado a cualquier toxina que un anti-toxina anticuerpo de cadena está disponible. Los métodos existentes para controlar el paso de toxinas en el citosol también se basan en un protocolo de fraccionami…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Digitonin	Sigma	D141
Ethanol	Acros	61509-0010
DMEM	Invitrogen	11995065
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
Ganglioside GM1	Sigma	G7641
CTA	Sigma	C2398
PTS1	List	182
NHS (N-Hydroxysuccinimide)	Pierce	24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)	Thermo Scientific	22981
Ethanolamine	Sigma	E0135
PBST	Medicago	09-8903-100
Anti-CTA antibody	Santa Cruz Biotech	sc-80747
Anti-CTB antibody	Calbiochem	227040
Anti-PTS1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-57639
Refractometer	Reichert	SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides	Reichert	13206060
Syringe pump	Cole Palmer	780200C