Eksplantater fra midthjernen dopaminsystemet og striatum anvendes i en collagenmatrix assay for<em> In vitro</em> Analyse af mesostriatal og striatonigral pathway udvikling. I dette assay axonal udvækst og vejledning kan manipuleres og kvantificeres. Det kan også modificeres til at vurdere andre regioner eller molekylære signaler.
Midthjernen dopamin (mdDA) neuroner projekt via mediale forhjernen bundle mod flere områder i telencephalon, herunder striatum 1. Omvendt medium piggede neuroner i striatum, der giver anledning til striatonigral (direkte) pathway innerverer substantia nigra 2. Udviklingen af disse axon skrifter er afhængig af de kombinatoriske handlinger foretaget af en overflod af axon vækst og vejledning signaler, herunder molekyler, der frigives ved neurites eller (mellemliggende) målregioner 3,4. Disse opløselige faktorer kan studeres in vitro ved dyrkning mdDA og / eller striatale eksplantater i en collagenmatrix, der tilvejebringer en tredimensionel substrat for axoner efterligner ekstracellulære miljø. Desuden tillader kollagenmatrixen til dannelse af relativt stabile gradienter af proteiner frigivet af andre eksplantater eller celler er anbragt i nærheden (se f.eks referencer 5 og 6). Her beskriver vi metoder til purverifikationsprogrammet af rotte hale kollagen, mikrodissektion af dopaminerge og striatale eksplantaterne, deres kultur i kollagengeler og efterfølgende immunhistokemiske og kvantitativ analyse. Første hjernerne af E14.5 museembryoer er isolerede og dopaminerge og striatale eksplantater mikrodissekeres. Disse eksplantater derefter (co) dyrket i kollagengeler på dækglas i 48 til 72 timer in vitro. Efterfølgende aksonal fremskrivninger er visualiseret ved hjælp af neuronale markører (fx tyrosin hydroxylase, DARPP32 eller βIII tubulin) og axon vækst og tiltrækkende eller frastødende axon svar er kvantificerede. Dette neuronal forberedelse er et nyttigt værktøj for de vitro-undersøgelser af de cellulære og molekylære mekanismer mesostriatal og striatonigral axon vækst og vejledning under udvikling. Ved hjælp af dette assay, er det også muligt at vurdere andre (mellemprodukt) mål for dopaminerge og striatale axoner eller at teste specifikke molekylære signaler.
Kollagenmatrixen assayet beskrevet her er blevet anvendt, og forbedret af mange forskellige laboratorier i de sidste årtier til at undersøge en række axon vejledning molekyler og neuronale systemer (se f.eks referencer 5-8). Disse undersøgelser har vist, at dette assay er et stærkt værktøj til at studere virkningerne og regulering af axon vejledning molekyler, der udskilles af forskellige (mellemprodukt) målvæv.
Imidlertid bør det bemærkes, at kollagenmatrixen er en erstatning for…
The authors have nothing to disclose.
Kollagenmatrix'en analysen er blevet udviklet og forbedret af arbejdet i mange forskellige forskergrupper i løbet af de seneste to til tre årtier. De beskrevne fremgangsmåder her for dopaminerge og striatale eksplantaterne stor gavn af disse undersøgelser. Desuden ville forfatterne gerne takke Asheeta Prasad for hendes hjælp til opsætning striatale eksplantatkulturer. Arbejde i laboratoriet blev finansieret af Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), Nederlandene Organization of Health Research og udvikling (ZonMW-VIDI og ZonMW-TOP), den Europanian Union (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222.999) (til RJP), og Holland Organisation for Videnskabelig Forskning (TopTalent, at ERES).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
Hepes | VWR International | 441476L | |
β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |