विच्छेदन और माउस डोपामिनर्जिक और तीन आयामी कोलेजन मैट्रिक्स Assays में striatal explants की संस्कृति
Summary
Midbrain dopamine प्रणाली और striatum से explants के लिए एक कोलेजन मैट्रिक्स परख में उपयोग किया जाता है<em> इन विट्रो में</em> Mesostriatal और striatonigral मार्ग के विकास का विश्लेषण. इस परख में axonal परिणाम और मार्गदर्शन और चालाकी से किया जा सकता है मात्रा. यह भी अन्य क्षेत्रों या आणविक संकेत का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Abstract
Midbrain dopamine (mdDA) औसत दर्जे का अग्रमस्तिष्क बंडल telencephalon में striatum एक सहित कई क्षेत्रों की ओर न्यूरॉन्स परियोजना के माध्यम से. आपस में, striatum में मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स कि striatonigral मार्ग (सीधा) को जन्म दे substantia nigra अंदर आना 2. इन इलाकों के अक्षतंतु विकास अक्षतंतु विकास और neurites द्वारा या लक्ष्य (मध्यवर्ती) 3,4 क्षेत्रों के द्वारा जारी कर रहे हैं अणुओं है कि सहित मार्गदर्शन संकेत के एक बहुतायत के मिश्रित कार्रवाई पर निर्भर है. ये घुलनशील कारकों संवर्धन mdDA और / या कोलेजन मैट्रिक्स है जो बाह्य वातावरण की नकल उतार axons के लिए एक तीन आयामी प्रदान करता है सब्सट्रेट में striatal explants द्वारा इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है. इसके अलावा, कोलेजन मैट्रिक्स अन्य explants या आसपास 5 संदर्भ और 6 (उदाहरण देखें) में रखा कोशिकाओं द्वारा जारी प्रोटीन की अपेक्षाकृत स्थिर ढ़ाल के गठन के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम पुर के लिए तरीके का वर्णनचूहे की पूंछ कोलेजन, डोपामिनर्जिक और striatal explants के के microdissection कोलेजन जैल और बाद immunohistochemical और मात्रात्मक विश्लेषण में, उनकी संस्कृति की ification. सबसे पहले, E14.5 माउस भ्रूण के दिमाग अलग और डोपामिनर्जिक हैं और striatal explants microdissected हैं. इन explants तो (सह) coverslips पर कोलेजन जैल में इन विट्रो में 48 से 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत. इसके बाद, अक्षतंतु संबंधी अनुमानों neuronal मार्कर (जैसे tyrosine hydroxylase, DARPP32, या βIII ट्यूबिलिन) और अक्षतंतु विकास और आकर्षक या प्रतिकारक अक्षतंतु प्रतिक्रियाओं की मात्रा निर्धारित कर रहे हैं का उपयोग कर कल्पना की जाती है. इस neuronal तैयारी के लिए mesostriatal और striatonigral अक्षतंतु विकास और विकास के दौरान मार्गदर्शन के सेलुलर और आणविक तंत्र की इन विट्रो अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण है. इस परख का उपयोग करना, यह भी डोपामिनर्जिक और striatal axons के लिए अन्य (मध्यवर्ती) लक्ष्य का आकलन करने के लिए संभव है या विशिष्ट आणविक संकेत परीक्षण.
Protocol
Discussion
कोलेजन मैट्रिक्स परख यहाँ वर्णित इस्तेमाल किया गया है और पिछले दशकों में कई अलग अलग प्रयोगशालाओं द्वारा सुधार अक्षतंतु मार्गदर्शन अणुओं और neuronal प्रणालियों की एक किस्म की जांच (जैसे 5-8 संदर्भ देखें). इन ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोलेजन मैट्रिक्स परख विकसित किया गया है और पिछले दो से तीन दशकों के दौरान कई विभिन्न अनुसंधान समूहों के काम में सुधार है. डोपामिनर्जिक और striatal explants के के लिए यहाँ वर्णित दृष्टिकोण बहुत इन अध्ययनों से लाभ. इसके अलावा, लेखक के लिए उसकी मदद के लिए striatal explant संस्कृतियों की स्थापना में Asheeta प्रसाद धन्यवाद करना चाहते हैं. प्रयोगशाला में काम मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम संगठन (कैरियर विकास पुरस्कार) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, नीदरलैंड स्वास्थ्य अनुसंधान और विकास संगठन (ZonMW – Vidi और ZonMW के टॉप), Europanian संघ (mdDA NeuroDev, FP7/2007-2011 के 222,999 अनुदान) (लिए RJP के लिए), और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (TopTalent, ERES).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
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