Disseksjon og kultur Mouse dopaminerg og striatale banene explants i tredimensjonale kollagen matrise Analyser
Summary
Explants fra midbrain dopamin systemet og striatum brukes i en kollagen matrise analysen for<em> In vitro</em> Analyse av mesostriatal og striatonigral veien utvikling. I denne analysen aksonal utvekst og veiledning kan manipuleres og kvantifiseres. Det kan også endres for å vurdere andre regioner eller molekylære signaler.
Abstract
Midbrain dopamin (mdDA) nevronene prosjektet via den mediale forebrain bunten mot flere områder i telencephalon, inkludert striatum en. Gjensidig, medium spiny nevroner i striatum som gir opphav til striatonigral (direkte) veien innervate substantia nigra 2. Utviklingen av disse axon traktater er avhengig av kombinatoriske handlingene til en overflod av axon vekst og veiledning pekepinner inkludert molekyler som er utgitt av neurites eller (middels) målrettingsregioner 3,4. Disse løselige faktorer kan studeres in vitro av dyrkning mdDA og / eller striatale banene explants i en kollagen matrise som gir en tredimensjonal substrat for axoner etterligne ekstracellulære miljøet. I tillegg gjør kollagen matrise for dannelsen av relativt stabile gradienter av proteiner utgitt av andre explants eller celler plassert i nærheten (f.eks se referanser 5 og 6). Her beskriver vi metoder for purification av rotte hale kollagen, mikrodisseksjon av dopaminerge og striatale banene explants, deres kultur i kollagen gel og påfølgende immunhistokjemisk og kvantitativ analyse. Først hjernen til E14.5 mus embryoer er isolert og dopaminerge og striatale banene explants er microdissected. Disse explants blir deretter (co) dyrket i kollagen gel på Dekkglass for 48 til 72 timer i vitro. Deretter aksonale anslag er visualisert ved hjelp av nevrale markører (f.eks tyrosin hydroksylase, DARPP32, eller βIII tubulin) og axon vekst og attraktive eller frastøtende axon respons kvantifiseres. Dette neuronal forberedelse er et nyttig verktøy for in vitro studier av cellulære og molekylære mekanismer for mesostriatal og striatonigral axon vekst og veiledning under utvikling. Ved hjelp av denne analysen, er det også mulig å vurdere andre (mellomliggende) mål for dopaminerge og striatale banene axons eller for å teste spesifikke molekylære signaler.
Protocol
Discussion
Kollagen matrise analysen beskrives her har blitt brukt og forbedret av mange ulike laboratorier i de siste tiårene for å undersøke en rekke axon veiledning molekyler og nevrale systemer (f.eks se referanser 5-8). Disse studiene har vist at denne analysen er et kraftig verktøy for å studere effekter og regulering av axon veiledning molekyler utskilles av forskjellige (middels) målvevet.
Imidlertid bør det bemerkes at kollagen matrisen er en erstatning for den ekstracellulære miljøet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kollagen matrise analysen har blitt utviklet og forbedret av arbeidet til mange ulike forskningsgrupper i løpet av de siste to-tre tiår. De tilnærminger som beskrives her for dopaminerge og striatale banene explants stor nytte av disse studiene. I tillegg ønsker forfatterne takke Asheeta Prasad for hennes hjelp i å sette opp striatale banene eksplantering kulturer. Arbeid i laboratoriet ble finansiert av Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), den nederlandske organisasjonen for helse Forskning og Utvikling (ZonMW-Vidi og ZonMW-TOP), den Europanian Union (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222 999) (til RJP), og den nederlandske organisasjonen for Scientific Research (TopTalent; til Eres).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
- Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
