Disección y Cultura de ratón dopaminérgico estriatal en explantes y tridimensionales ensayos matriz de colágeno
Summary
Los explantes procedentes del sistema de la dopamina mesencéfalo y el cuerpo estriado se utilizan en un ensayo para la matriz de colágeno<em> In vitro</em> Análisis del desarrollo y la vía mesoestriatales estriatonigral. En este ensayo crecimiento axonal y orientación puede ser manipulado y cuantificados. También se puede modificar para evaluar otras regiones o señales moleculares.
Abstract
La dopamina del cerebro medio (MDDA) neuronas se proyectan a través del haz medial del cerebro anterior hacia varias áreas en el telencéfalo, incluyendo el cuerpo estriado 1. Recíprocamente, las neuronas espinosas medias en el cuerpo estriado que dan lugar a la estriatonigral (directa) y la vía inervan la sustancia negra 2. El desarrollo de estas extensiones del axón depende de las acciones de combinatorias de una gran cantidad de crecimiento de los axones y las señales de orientación que incluyen moléculas que se liberan por neuritas o por regiones de destino (nivel intermedio) de 3,4. Estos factores solubles pueden ser estudiados in vitro por MDDA cultivo y / o explantes estriatales en una matriz de colágeno que proporciona un sustrato tridimensional para los axones que imitan el entorno extracelular. Además, la matriz de colágeno permite la formación de gradientes relativamente estables de proteínas liberadas por explantes otras células y colocados en la proximidad (por ejemplo, véanse las referencias 5 y 6). Aquí se describen los métodos para las comficación de colágeno de cola de rata, microdisección de los explantes dopaminérgicos del cuerpo estriado, y, de su cultura en geles de colágeno y su posterior análisis inmunohistoquímico y cuantitativo. En primer lugar, los cerebros de embriones de ratón E14.5 están aislados y dopaminérgico estriatal y los explantes se microdissected. Estos explantes son entonces (co) cultivadas en geles de colágeno en cubreobjetos de 48 a 72 horas de vitro. Posteriormente, las proyecciones axonales se visualizan utilizando marcadores neuronales (por ejemplo, la tirosina hidroxilasa, DARPP32 o tubulina βIII) y crecimiento de los axones y las respuestas de los axones atractivas o repulsivas son cuantificados. Esta preparación neuronal es una herramienta útil para los estudios in vitro de los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento de los axones y mesoestriatales estriatonigral y orientación durante el desarrollo. Utilizando este ensayo, también es posible evaluar otros (intermedio) objetivos para los axones dopaminérgicos y estriado o para probar específicos señales moleculares.
Protocol
Discussion
El ensayo de matriz de colágeno se describe aquí se ha utilizado y mejorado por muchos laboratorios diferentes en las últimas décadas para investigar una variedad de moléculas de guiado de los axones neuronales y sistemas (por ejemplo, véanse las referencias 5-8). Estos estudios han demostrado que este ensayo es una poderosa herramienta para estudiar los efectos y la regulación de las moléculas de orientación axón secretadas por diferentes tejidos diana (intermedio).
Sin embargo, d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El ensayo de matriz de colágeno se ha desarrollado y mejorado por el trabajo de muchos grupos de investigación durante los últimos dos o tres décadas. Los enfoques descritos aquí para explantes dopaminérgicos del cuerpo estriado, y se benefician enormemente de estos estudios. Además, los autores desean agradecer a Asheeta Prasad por su ayuda en la creación de culturas del cuerpo estriado de explantes. El trabajo en el laboratorio fue financiado por la organización del programa Human Frontier Science (Premio a la Trayectoria para el Desarrollo), la Organización Holandesa de Investigación en Salud y el Desarrollo (ZonMW-VIDI y ZonMW TOP), la Unión Europanian (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (para RJP), y la Organización Holandesa de Investigación Científica (TopTalent; de ERES).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
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