Dissektion och kultur mus dopaminerga och Striatala Explantat i tredimensionella analyser kollagenmatris
Summary
Explantat från mitthjärnan dopaminsystemet och striatum används i en kollagenmatris analys för<em> In vitro</em> Analys av mesostriatal och striatonigral väg utveckling. Vid denna analys axonutväxt och vägledning kan manipuleras och kvantifieras. Det kan också modifieras för att bedöma andra regioner eller molekylära signaler.
Abstract
Mitthjärnan dopamin (MDDA) neuroner projekt via den mediala framhjärnan bunt mot flera områden i telencephalon, inklusive striatum 1. På motsvarande sätt medelstora taggiga neuroner i striatum som ger upphov till striatonigral (direkt) väg innerverar substantia nigra 2. Utvecklingen av dessa axon trakter beror på de kombinatoriska agerande en uppsjö av axon tillväxt och signaler vägledning, inklusive molekyler som frisätts av neuriter eller (mellan) målregioner 3,4. Dessa lösliga faktorer kan studeras in vitro genom odling MDDA och / eller striatala explantat i en kollagen-matris som ger en tredimensionell substrat för axonerna imiterar extracellulära miljön. Dessutom medger den kollagen-matris för bildning av relativt stabila gradienter av proteiner som frisätts av andra explantat eller celler som placeras i området (se t.ex. referenserna 5 och 6). Här beskriver vi metoder för förvärvsmetodenification av råttsvanskollagen, mikrodissektion av dopaminerga och striatala explantat, kultur i kollagengeler och efterföljande immunohistokemisk och kvantitativ analys. Först hjärnan hos E14.5 musembryon är isolerade och dopaminerga och striatala explantaten microdissected. Dessa explantat därefter (sam) odlades i kollagengeler på täckglas i 48 till 72 timmar de vitro. Därefter axonala prognoserna visualiseras med neuronala markörer (t.ex. tyrosinhydroxylas, DARPP32 eller βIII tubulin) och axon tillväxt och attraktiva eller repulsiva svar axon är kvantifierade. Detta neuronala preparat är ett användbart verktyg för in vitro-studier av de cellulära och molekylära mekanismer för mesostriatal och striatonigral axon tillväxt och vägledning under utveckling. Användning av denna analys är det också möjligt att utvärdera andra (mellanliggande) mål för dopaminerga och striatala axoner eller för att testa specifika molekylära signaler.
Protocol
Discussion
Kollagenmatrisen analysen som beskrivs här har använts och förbättrats av många olika laboratorier under de senaste decennierna för att undersöka en rad olika axon vägledning molekyler och neuronala system (se t.ex. referenser 5-8). Dessa studier har visat att denna analys är ett kraftfullt verktyg för att studera effekterna och reglering av axon vägledande molekyler som utsöndras av olika (bra) målvävnader.
Emellertid bör det noteras att kollagenmatrisen är ett substitut fö…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kollagenmatrisen Analysen har utvecklats och förbättrats av arbetet av många olika forskargrupper under de senaste två till tre decennier. De metoder som beskrivs här för dopaminerga och striatum explantaten stor nytta dessa studier. Dessutom skulle författarna tacka Asheeta Prasad för hennes hjälp med att upprätta striatala explantatodlingarna. Arbetet i labbet har finansierats av Human Frontier Science Program Organisation (Career Development Award), Nederländerna Organisationen för Health Research och utveckling (ZonMW-VIDI och ZonMW-TOP), den Europanian unionen (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222.999) (till RJP) och Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (TopTalent, för att ERES).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
- Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
