Site-specifik bakteriekromosomet Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)
Summary
En hurtig og effektiv metode til at integrere fremmed DNA af interesse i præfremstillede acceptor stammer, betegnet landingsplads stammer, er beskrevet. Fremgangsmåden tillader stedspecifik integration af et DNA-kassette i det konstruerede landingsplads locus af en given stamme, gennem konjugation og ekspression af det ΦC31 integrase.
Abstract
Det bakterielle kromosom, kan anvendes til stabilt at opretholde fremmed DNA i mega-base mellem 1. Integration i kromosomet omgår emner såsom plasmidreplikation, plasmidstabilitet, plasmid uforenelighed, og antallet af plasmidkopier varians. Denne metode anvender den stedspecifikke integrase fra Streptomyces fagen (Φ) C31 2,3. Den ΦC31 integrase katalyserer en direkte rekombination mellem to specifikke DNA steder: attB og attP (34 og 39 bp, henholdsvis) 4. Denne rekombination er stabilt og ikke vende tilbage 5. En "landing pad" (LP) sekvensen bestående af en spectinomycin-resistens gen, Aada (SPR) og E. coli ß-glucuronidase-genet (uidA) flankeret af attP sites er blevet integreret i kromosomerne i Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi og Agrobacterium tumefaciens i en intergenisk region, ampC locus, og den tetA locus, hhv. S. meliloti anvendes i denne protokol. Mobiliserbar donor vektorer indeholdende attB-sites flankerer en stuffer rødt fluorescerende protein (RFP) gen og en antibiotisk resistens-gen er også blevet konstrueret. I dette eksempel gentamicin resistent plasmid pJH110 anvendes. RFP gen 6 kan erstattes med en ønsket konstruktion med Sph I og Pst I. Alternativt kan en syntetisk konstruktion flankeret af attB-sites kan være sub-klonet ind i en mobiliserbar vektor, såsom pK19mob 7. Ekspressionen af ΦC31 integrase-genet (klonet fra pHS62 8) drives af lac-promotoren på en mobiliserbar bredt værtsspektrum plasmid pRK7813 9.
En tetraparental parring protokol anvendes til at overføre donor kassetten i LP-stammen derved erstatte markører i LP-sekvensen med donor kassetten. Disse celler er trans-integranter. Trans-integranter er udformet med en typisk effektivitet på 0,5%. Trans-integranter er typisk inden for de første 500-1000 kolonier screenet ved antibiotisk følsomhed eller blå-hvid-screening ved anvendelse af 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glucuronsyre (X-gluc). Denne protokol indeholder de parring og udvælgelse procedurer for at skabe og isolere trans-integranter.
Protocol
Discussion
Den IMCE teknik muliggør effektiv integration af en enkelt attB flankeres DNA'et kassetten i LP-locus af en tidligere udviklet stamme. Når den ønskede konstruktion klones i stedet for RFP at skabe donor kassetten, er teknikken ikke kræver efterfølgende DNA-oprensning og transformation, hvilket gør det meget robust. Det er vigtigt, at passende vækst kontroller er indbefattet, for at være sikker på antibiotikaresistens skyldes indførelsen af trans-integranter og ikke andre faktorer. <…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
For at Margaret CM Smith for venlig at give integrase klon
Økonomisk støtte fra:
Genome Canada / Genome Prairie
NSERC Discovery og strategiske projekt tilskud
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Streptomycin | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicin | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| Tetracycline | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamycin | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Bacteriological grade agar | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Tryptone | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Yeast Extract | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Sodium Chloride | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Calcium Chloride | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli MT616 strain | Available upon request | Also used outside of our lab | |
| E. coli pJC2 strain | In house, available by request | ||
| E. coli pJH110 strain | In house, available by request | ||
| SmUW227 strain | In house, available by request |
References
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
- Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
- Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
- Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
- Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
- Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
- Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
- Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
- Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
- Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
- Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
- Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
- Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
- Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
- Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
- Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).
