الفحص Neuroblast: والفحص للانشاء وإثراء خلايا متعلق بالخلايا العصبية السلف من التفريق العصبية الجذعية آله الخلية باستخدام التدفق الخلوي
Summary
هذا البروتوكول الفيديو يشرح طريقة جديدة لتوليد وتنقية لاحق من الخلايا العصبية السلف من مصدر متجدد للخلايا الجذعية العصبية (NSCs) على أساس (الحبوبية حجم والداخلية) والخصائص الجسدية فلوري باستخدام تكنولوجيا تدفق الخلوي.
Abstract
يمكن عزل الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، وتوسعت في نطاق واسع، وذلك باستخدام الفحص neurosphere ومتباينة إلى ثلاثة أنواع رئيسية من خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وهي الخلايا النجمية، oligodendrocytes والخلايا العصبية. هذه الخصائص تجعل الجذعية العصبية والخلايا الاولية مصدرا قيما قابلة للتجديد الخلايا للدراسات في المختبر مثل فحص المخدرات، neurotoxicology والكهربية، وكذلك لعلاج استبدال الخلية في العديد من الأمراض العصبية. في الممارسة العملية، ومع ذلك، عدم تجانس ذرية مجلس الأمن القومي، وإنتاج منخفض من الخلايا العصبية وoligodendrocytes، وغلبة تمايز الخلايا النجمية بعد تحد تطبيقاتها السريرية. هنا، نحن تصف منهجية جديدة لتنقية جيل لاحق من الخلايا العصبية وغير ناضج من ذرية NSC الفئران باستخدام مضان الفرز الخلية تفعيلها (FACS) التكنولوجيا. باستخدام هذه المنهجية، يمكن التوصل الى التخصيب الخلية العصبية سلف سكان خفة دمالحوت أي نجمية ملحوظ وبحسن نية تلوث مجلس الأمن القومي. الإجراء يشمل التفريق بين ذرية معزولة وتوسيع مجلس الأمن القومي من eminences الماوس E14 العقدية باستخدام مقايسة neurosphere، تليها العزلة وإثراء غير ناضج الخلايا العصبية على أساس خصائصها الفيزيائية (الحجم والتعقيد الداخلية) وفلوري باستخدام تكنولوجيا تدفق الخلوي. وعموما، يستغرق 5-7 أيام لتوليد neurospheres و 6-8 أيام في التفريق NSC ذرية وعزل عالي النقاء الخلايا العصبية غير ناضج.
Protocol
Discussion
قد القدرة على عزل تعريف السكان الخلايا العصبية (العصبونات، أي الخلايا النجمية وoligodendrocytes) حل بعض العقبات المرتبطة التطبيق السريري من الخلايا الجذعية العصبية (NSCs). الأول، أنه يساعدنا على وصف كامل للسكان بدءا من الخلايا المانحة. الثانية، لأنها تتيح لنا استخدام نوع خلية…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة Overstreet.
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
References
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
