Den Neuroblast analysen: en analyse for generering og berikelse av neuronal stamceller fra Skille Neural Stem Cell familie Bruke flowcytometrisystemer
Summary
Denne videoen protokollen viser en ny metode for produksjon og etterfølgende rensing av nevrale stamceller fra en fornybar kilde til nevrale stamceller (NSCs) basert på deres fysiske (størrelse og intern granularitet) og fluorescerende egenskaper ved hjelp av flowcytometri teknologi.
Abstract
Nevrale stamceller (NSCs) kan isoleres og utvidet i stor skala, med neurosphere analysen og differensiert i de tre store celletyper i sentralnervesystemet (CNS), nemlig astrocytes og oligodendrocytes og nevroner. Disse egenskapene gjør nevrale stilk og stamceller en uvurderlig fornybar kilde til celler for in vitro-studier som narkotika screening, neurotoxicology og elektrofysiologi og også for celle erstatning terapi i mange nevrologiske sykdommer. I praksis vil imidlertid heterogenitet av NSC avkom, lav produksjon av nevroner og oligodendrocytes, og overvekt av astrocytes følgende differensiering begrense sine kliniske anvendelser. Her beskriver vi en roman metode for generering og påfølgende rensing av umodne nerveceller fra murine NSC avkom med fluorescens aktivert celle sortering (FACS) teknologi. Ved hjelp av denne metoden, kan en høyanriket nevronale stamceller befolkning oppnås viddHout noen merkbar astrocyte og bona fide NSC forurensning. Prosedyren omfatter differensiering av NSC avkom isolert og utvidet fra E14 mus ganglionic eminenser bruker neurosphere analysen, etterfulgt av isolasjon og berikelse av umodne nevrale celler basert på deres fysiske (størrelse og intern kompleksitet) og fluoriserende egenskaper ved hjelp av flowcytometri teknologi. Samlet, tar det 5-7 dager å generere neurospheres og 6-8 dager til å differensiere NSC avkommet og isolere svært renset umodne nevronale celler.
Protocol
Discussion
Muligheten til å isolere definerte nevrale celle populasjoner (dvs. nevroner, astrocytes og oligodendrocytes) kan løse noen av de hindringer knyttet til klinisk anvendelse av nevrale stamceller (NSCs). Først gjør det oss til å fullt ut karakterisere starter befolkning av donor cellene. For det andre gir det oss å bruke en bestemt celletype eller en kombinasjon av forskjellige celletyper med en bestemt ratio, avhengig av art eller stadium av sykdommen. Til slutt kan bruke høyanriket pre-differensierte nevrale cell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av midler fra Overstreet Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
References
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
