Le test neuroblaste: Un test pour la génération et l'enrichissement des cellules souches neuronales à partir de différenciation des cellules souches neurales Progeny Par cytométrie en flux

Résumé

Ce protocole vidéo démontre une nouvelle méthode pour la génération et la purification ultérieure des cellules progénitrices neuronales à partir d'une source renouvelable de cellules souches neurales (CSN) en fonction de leur physique (taille et granularité interne) et les propriétés fluorescentes en utilisant la technologie de cytométrie en flux.

Résumé

Les cellules souches neurales (CSN) peuvent être isolés et élargi à grande échelle, en utilisant le test neurosphères et différenciés dans les trois principaux types de cellules du système nerveux central (SNC); à savoir, les astrocytes, oligodendrocytes et des neurones. Ces caractéristiques font de souches neurales et les cellules progénitrices une source inestimable renouvelable de cellules pour des études in vitro, tels que le dépistage des drogues, neurotoxicologie et l'électrophysiologie et aussi pour la thérapie de remplacement cellulaire dans de nombreuses maladies neurologiques. En pratique, cependant, l'hétérogénéité de la descendance NSC, la faible production de neurones et des oligodendrocytes, les astrocytes et la prédominance de la suite de différenciation limiter leurs applications cliniques. Ici, nous décrivons une nouvelle méthodologie pour la purification de production et subséquente des neurones immatures de NSC descendance murin utilisant la fluorescence tri cellulaire (FACS) de la technologie. En utilisant cette méthodologie, une population hautement enrichi de cellules souches neuronales peuvent être atteints d'espritHout toute astrocytes notable et de bonne foi la contamination NSC. La procédure comprend la différenciation des produits de filiation du NSC isolé et agrandi à partir de E14 éminences ganglionnaires de souris en utilisant le test neurosphères, suivie par l'isolement et l'enrichissement de cellules immatures neuronaux en fonction de leurs propriétés physiques (taille et la complexité interne) et fluorescente utilisant la technologie de cytométrie en flux. Dans l'ensemble, cela prend 5-7 jours pour générer neurosphères et 6-8 jours pour différencier descendance NSC et d'isoler hautement purifié des cellules neuronales immatures.

Protocole

1. Basic Set Up Avant de procéder à la culture cellulaire

1. NeuroCult NSC milieu de base et les suppléments NeuroCult NSC prolifération sont mélangés à un rapport 9:1, respectivement, de faire du milieu complet NSC.
2. Un bain à 37 ° C est utilisée pour réchauffer le milieu.
3. Quantité appropriée de inactivé par la chaleur sérum de veau foetal (FCS) est décongelé.
4. Quantité appropriée de solutions d'achat d'actions du facteur de croissance, y compris le facteur de croissance épidermique (EGF à 10 pg / ml), le facteur de croissance fibroblastique (b-FGF à 10 pg / ml) et 0,2% solution d'héparine dans un tampon phosphate sali....

Discussion

La capacité d'isoler des populations définies de cellules neurales (neurones à savoir, astrocytes et oligodendrocytes) pourrait résoudre certains des obstacles associés à l'application clinique des cellules souches neurales (CSN). Tout d'abord, il nous permet de caractériser complètement la population de départ de cellules du donneur. Deuxièmement, il nous permet d'utiliser un type cellulaire particulier ou une combinaison de différents types de cellules avec un rapport spécifique, en fonction de la natu.......

Matériaux

Nom du réactif	Type	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NeuroCult NSC moyen basal	Moyen	Technologies des cellules souches	05700
NeuroCult NSC suppléments prolifération	Supplément moyen	Technologies des cellules souches	05701
0,05% de trypsine-EDTA	Réactif	Gibco	25300-062
Inhibiteur de trypsine de soja	Réactif	Sigma	T6522
Pen / Strep	Réactif	Gibco	15140-122
* MEM	Réactif	Gibco	41500-018	Composante HEM
* Les HEPES	Réactif	Sigma	H4034	Composante HEM
* L'eau distillée	Réactif	Gibco	15230-147
Tamis cellulaire	Tamis	BD Falcon	352340
T25 flacon	Culture de la céramique	Nalge Nunc internationale	136196
T80 flacon	Culture de la céramique	Nalge Nunc internationale	178905
Tubes de 15 ml	Culture de la céramique	BD Falcon	352096
Tubes de 50 ml	Culture de la céramique	BD Falcon	352070
EGF	Facteur de croissance	R & D	2028-EG
b-FGF	Facteur de croissance	R & D	3139-FB
Héparine	Facteur de croissance	Sigma	H4784	Reconstitué dans du PBS
Anti-PSA-NCAM-PE	Anticorps	Miltenyi Biotec	130-093-274
IgG1 souris PE-conjugué	Anticorps de contrôle isotypique	BD Pharminogen	556029
Héparine	Facteur de croissance	Sigma	H4784	Reconstitué dans du PBS
PMOrh-4	Facteur de croissance	R & D	314-BP-010
Poly-L-Ornithine	Réactif	Sigma	P4957
Sérum de veau foetal	Supplément moyenne	Gibco	10099-141
GFAP	Anticorps	DAKO	Z0334
B-III tubuline	Anticorps	Promega	G7121

* Pour faire HEM, mélange 1 sachet x L 10 du MEM et 160 ml de HEPES 1M et porter le volume à 8,75 L avec de l'eau distillée. Réglez le pH final à 7,4 et le conserver à 4 ° C.