Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie
Summary
Diese Video-Protokoll zeigt ein neues Verfahren zur Erzeugung und anschließender Reinigung von neuronalen Vorläuferzellen aus einer erneuerbaren Quelle von neuralen Stammzellen (NSC) an körperlicher (Größe und Granularität internen) und fluoreszierenden Eigenschaften unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Technologie.
Abstract
Neurale Stammzellen (NSC) isoliert und in erweitert werden große, mit der Neurosphere Assay und differenzierten zu den drei Zelltypen des zentralen Nervensystems (CNS), nämlich, Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen. Diese Eigenschaften machen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen eine wertvolle erneuerbare Quelle von Zellen für in vitro-Studien wie Wirkstoff-Screening, Neurotoxikologie und Elektrophysiologie und auch für die Zell-Ersatz-Therapie bei vielen neurologischen Erkrankungen. In der Praxis jedoch, die Heterogenität der NSC Nachkommen, geringe Produktion von Neuronen und Oligodendrozyten und Astrozyten Vorherrschen nach der Differenzierung beschränken ihre klinische Anwendungen. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode für die Erzeugung und anschließende Reinigung der unreifen Neuronen aus murinen NSC Nachkommen mittels Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS)-Technologie. Mit dieser Methode kann ein hoch angereichertes neuronalen Vorläuferzellen Zellpopulation Witz erreicht werdenHout keine spürbaren Astrozyten und bona fide NSC Kontamination. Das Verfahren umfasst Differenzierung von NSC Nachkommenschaft isoliert und expandiert von E14 Maus ganglionären Eminenzen mit dem Neurosphäre Assay, durch Isolierung und Anreicherung von unreifen neuronalen Zellen auf der Basis ihrer physikalischen (Größe und interne Komplexität) und fluoreszierenden Eigenschaften mittels Durchflusszytometrie Technologie gefolgt. Insgesamt dauert es 5-7 Tage, um Neurosphären und 6-8 Tage zu erzeugen, um NSC Nachkommen zu unterscheiden und zu isolieren hochgereinigten unreifen neuronalen Zellen.
Protocol
Discussion
Die Möglichkeit, definierte neuronale Zellpopulationen zu isolieren (dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) lösen könnten einige der Hindernisse bei der klinischen Anwendung der neuralen Stammzellen (NSCs) verbunden sind. Erstens ermöglicht es uns für die vollständige Charakterisierung der Ausgangspopulation von Spenderzellen. Zweitens erlaubt es uns, einen bestimmten Zelltyp oder eine Kombination von verschiedenen Zelltypen mit einem bestimmten Verhältnis zu verwenden, je nach Art oder das Stadium der Erk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Overstreet Stiftung unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
References
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