Neuroblast परख: पीढ़ी और neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का संवर्धन फर्क तंत्रिका स्टेम सेल संतान से फ्लो का प्रयोग के लिए एक परख
Summary
इस वीडियो प्रोटोकॉल पीढ़ी और neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के बाद शुद्धि तंत्रिका स्टेम सेल का एक अक्षय स्रोत (एनएससी) से उनकी शारीरिक (आकार और आंतरिक granularity) और गुण फ्लोरोसेंट प्रवाह cytometry प्रौद्योगिकी का उपयोग के आधार पर के लिए एक उपन्यास विधि को दर्शाता है.
Abstract
तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) और अलग किया जा सकता है में विस्तार बड़े पैमाने पर, neurosphere परख का उपयोग कर और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) प्रणाली के तीन प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव, अर्थात्, astrocytes oligodendrocytes, और न्यूरॉन्स. इन विशेषताओं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और पूर्वपुस्र्ष को दवा स्क्रीनिंग, neurotoxicology, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के रूप में इन विट्रो अध्ययन में और भी कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में सेल प्रतिस्थापन उपचार के लिए के लिए एक अमूल्य कोशिकाओं के अक्षय स्रोत बनाते हैं. अभ्यास में, तथापि, एनएससी संतान, न्यूरॉन्स और oligodendrocytes का कम उत्पादन है, और भेदभाव के बाद उनके नैदानिक अनुप्रयोगों सीमा astrocytes की प्रबलता की विविधता है. यहाँ, हम murine एनएससी संतान से अपरिपक्व न्यूरॉन्स प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) तकनीक का उपयोग कर की पीढ़ी और बाद में शुद्धीकरण के लिए एक उपन्यास पद्धति का वर्णन. इस पद्धति का उपयोग करना, अत्यधिक समृद्ध neuronal पूर्वपुस्र्ष सेल आबादी बुद्धि प्राप्त किया जा सकता हैकिसी भी ध्यान देने योग्य अस्थिकणिका और प्रामाणिक एनएससी संदूषण hout. प्रक्रिया एनएससी संतान अलग और E14 माउस ganglionic neurosphere परख का उपयोग eminences, उनके (आकार और आंतरिक जटिलता) और शारीरिक फ्लोरोसेंट प्रवाह cytometry प्रौद्योगिकी का उपयोग गुण के आधार पर अलगाव और अपरिपक्व neuronal कोशिकाओं के संवर्धन के बाद से विस्तार की भिन्नता शामिल है. कुल मिलाकर, यह 5-7 दिनों के लेता है neurospheres और 6-8 दिनों उत्पन्न करने के लिए एनएससी संतान अंतर और अत्यधिक शुद्ध अपरिपक्व neuronal कोशिकाओं को अलग.
Protocol
Discussion
परिभाषित तंत्रिका कोशिका आबादी को अलग करने की क्षमता (यानी न्यूरॉन्स astrocytes और oligodendrocytes) के तंत्रिका स्टेम सेल के नैदानिक अनुप्रयोग (एनएससी) के साथ जुड़े बाधाओं का समाधान हो सकता है. सबसे पहले, यह हमें सक्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम Overstreet फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
References
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
