Den Neuroblast Analys: En analys för generering och anrikning av neuronala progenitorceller från Skilja Neural Stem Cell Progeny med hjälp av flödescytometri
Summary
Denna video protokoll visar en ny metod för generering och efterföljande rening av neuronala progenitorceller från en förnybar källa av neurala stamceller (NSC) baserat på deras fysikaliska (storlek och granularitet inre) och fluorescerande egenskaper med användning av tekniken flödescytometri.
Abstract
Neurala stamceller (NSC) kan isoleras och expanderas i stor skala, med användning av neurosfären analysen och differentieras till de tre huvudsakliga celltyperna i det centrala nervsystemet (CNS); nämligen, astrocyter, oligodendrocyter och neuroner. Dessa egenskaper gör neurala stam-och progenitorceller en ovärderlig förnybar celler för in vitro-studier som drog screening, neurotoxikologi och elektrofysiologi och också för cell substitutionsterapi hos många neurologiska sjukdomar. I praktiken har dock heterogenitet NSC avkomma, låg produktion av nervceller och oligodendrocyter och dominans astrocyter efter differentiering begränsa deras kliniska tillämpningar. Här beskriver vi en ny metod för generering och efterföljande rening av omogna nervceller från mus NSC avkommor med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) teknik. Med denna metod kan en höganrikat neuronal stamceller population uppnås witHout någon märkbar astrocyt och bona fide NSC förorening. Förfarandet omfattar en differentiering av NSC avkommor isolerade och expanderat från E14 mus ganglieblockerande höjder med hjälp av neurosfären analysen, följt av isolering och anrikning av omogna nervceller baserat på deras fysiska (storlek och interna komplexitet) och fluorescerande egenskaper med hjälp av teknik flödescytometri. Sammantaget tar det 5-7 dagar att skapa neurosfärer och 6-8 dagar för att skilja NSC avkomma och isolera renat omogna nervceller.
Protocol
Discussion
Förmågan att isolera definierade neurala cellpopulationer (dvs neuroner, astrocyter och oligodendrocyter) kan lösa vissa av de hinder som är förknippade med den kliniska tillämpningen av neurala stamceller (NSC). För det första kan det för oss att fullständigt karaktärisera utgångspopulation av givarceller. För det andra möjliggör för oss att använda en speciell celltyp eller en kombination av olika celltyper med ett specifikt förhållande, beroende på naturen eller stadium av sjukdomen. Slutligen kan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes genom finansiering från Overstreet Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
References
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
