Neuroblast Test: Akım Sitometri Kullanımı Farklılaşan Nöral Kök Hücre Döl nöronal Progenitör Hücrelerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için bir Testi
Summary
Bu video protokolü akış sitometrisi teknolojisi kullanılarak fiziksel (boyutu ve iç boyu) ve floresan özelliklerine bağlı olarak kök sinir hücrelerini yenilenebilir bir kaynaktan (NSC'lerde) den nöronal progenitör hücre üretimi ve daha sonra saflaştırma için yeni bir yöntem gösterilmektedir.
Abstract
Nöral kök hücreler (NSC'lerde) izole ve genişletilebilir büyük ölçekli, neurosphere testi kullanılarak ve merkezi sinir sistemi (MSS) üç ana hücre tiplerine diferansiye; yani, astrositler, oligodendrosit ve nöronlar. Bu özellikler nöral kök ve progenitör hücreler, uyuşturucu taraması, neurotoxicology ve elektrofizyoloji gibi in vitro çalışmalar ve birçok nörolojik hastalıklarda hücre replasman tedavisi için kullanılması için hücre paha biçilmez bir yenilenebilir kaynak haline getiriyor. Ancak pratikte, MGK döl, nöronlar ve oligodendrosit düşük üretim ve farklılaşma klinik uygulamaları sınırlamak takip astrositlerin baskın heterojen. Burada, floresans aktive hücre ayırma (FACS) teknolojisi kullanılarak mürin NSC soyu ile olgunlaşmamış nöronların kuşak ve sonraki temizleme için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, zenginleştirilmiş nöronal progenitör hücre popülasyonu zekâ elde edilebilirherhangi bir fark astrosit ve iyi niyetli MGK kirlenme olduğu görüldü. Prosedürü MGK döl izole ve akım sitometri teknolojisini kullanarak fiziksel (boyut ve iç karmaşıklık) ve floresan özelliklerine göre olgunlaşmamış nöronal hücrelerin izolasyonu ve zenginleşmesi ile takip neurosphere testi kullanılarak E14 fare ganglionik tubera, genişletilmiş farklılaşma içerir. Genel olarak, MGK döl ayırt etmek neurospheres ve 6-8 gün üretmek için 5-7 gün sürer ve çok olgunlaşmamış nöronal hücrelerin saf izole.
Protocol
Discussion
Tanımlanan sinir hücre popülasyonu izole yeteneği (yani nöron, astrositler ve oligodendrosit) nöral kök hücrelerin klinik uygulama (NSC'lerde) ile ilişkili bazı engelleri çözebilir. İlk olarak, tamamen donör hücrelerinin başlangıç nüfusu karakterize mümkün kılmaktadır. İkincisi, bizim hastalığın doğasına ve aşama bağlı olarak, belirli bir oranı ile, belirli bir hücre tipinde ya da farklı hücre tipleri bir kombinasyonunu kullanmak için olanak sağlar. Son olarak, zenginleşt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Overstreet Vakfı'nın fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
References
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
