En rask og nøyaktig point-of-care test for invasiv pulmonal aspergillose presenteres. Det tar fordel av lateral-flow teknologi i et spesifikt monoklonalt antistoff som binder seg til en<em> Aspergillus</em> Antigen utskilles under lungeinfeksjoner. Den analysen er kompatibel med serum og brochoalveolar lavage og representerer en ny medhjelper test for sykdommen diagnose.
Invasiv pulmonal aspergillose (IPA) er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet i hematologisk malignitet pasienter og stamcelletransplantasjon resipienter 1. Påvisning av IPA representerer en formidabel diagnostisk utfordring og, i mangel av en "gullstandard", avhengig av en kombinasjon av kliniske data og mikrobiologi og histopatologi hvor gjennomførbart. Diagnose av IPA må følge den europeiske organisasjonen for forskning og behandling av kreft og National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer mykologi Study Group (EORTC / MSG) konsensus definere "bevist", "sannsynlig" og "mulig" invasive soppsykdommer 2 . Foreløpig har ingen nukleinsyre-baserte tester blitt eksternt validert for IPA deteksjon og så polymerase kjedereaksjon (PCR) er ikke inkludert i dagens EORTC / MSG diagnostiske kriterier.
Identifisering av Aspergillus i histologiske deler er problematisk på grunn av Similarities i hyphal morfologi med andre invasive sopp 3 og velprøvd identifisering krever isolering av etiologic agent i ren kultur. Kultur-baserte tilnærminger stole på tilgjengeligheten av biopsiprøver, men disse er ikke alltid tilgjengelig i syke pasienter, og ikke alltid gir levedyktige propagules for kultur når innhentet.
Et viktig trekk i patogenesen av Aspergillus er angio-invasjon, en egenskap som gir muligheter til å spore soppen immunologisk bruke tester som gjenkjenner karakteristiske antigene signaturer molekyler i serum og bronchoalveolar lavage (BAL) væsker. Dette har ført til utviklingen av Platelia enzymet immunoassay (GM-EIA) som oppdager Aspergillus galactomannan og en "pan-sopp" analysen (Fungitell test) som oppdager konservert soppens cellevegg komponent (1 → 3)-β-D- glukan, men ikke i mucorales som mangler denne komponenten i sin celle vegger 1,4. Ersaksøker rundt nøyaktigheten av disse testene 1,4-6 har ført til den siste utviklingen av neste generasjons monoklonalt antistoff (MAB)-baserte analyser som gjenkjenner surrogat infeksjonsmarkører 1,5.
Thornton 5 nylig beskrev generering av en Aspergillus-spesifikk MAB (JF5) med hybridoma teknologi og bruken for å utvikle en immuno-kromatografisk lateral-flow enhet (LFD) for point-of-care (POC) diagnose av IPA. En stor fordel av LFD er dens evne til å oppdage aktivitet siden MAB JF5 binder seg til en ekstracellulær glycoprotein antigen som utskilles under aktiv vekst av sopp bare fem. Dette er et viktig hensyn ved bruk av væsker som lunge BAL for diagnostisering IPA siden Aspergillus sporer er en vanlig komponent i innåndingsluften. Nytten av enheten i diagnostisering IPA har blitt demonstrert ved hjelp av en dyremodell for infeksjon, hvor LFD vises forbedret sensitivitet og specificity forhold til Platelia GM og Fungitell (1 → 3)-β-D-glukan analyser 7.
Her presenterer vi en enkel LFD prosedyre for å oppdage Aspergillus antigen i humant serum og BAL væsker. Dens hastighet og nøyaktighet gir en roman supplement point-of-care test for diagnostisering av IPA i hematologisk malignitet pasienter.
Definitive identifikasjon av IPA kan bare virkelig oppnås ved isolasjon av etiologic agent fra biopsiprøver, men gjenvinning av egnede prøver er ofte ikke mulig i svært syke pasienter og Aspergillus er sjelden inndrives fra blod. Mens store fremskritt har blitt gjort i bruken av computertomografi skanning av brystet i IPA diagnose, egenskaper som er forenlig med pulmonal IPA som "Halo" eller "air-halvmåne" skiltene er enten forbigående eller kan tilskrives puste artefakter eller andre soppinfeksjoner 11,12. Slike data er derfor supplert med serologiske teknikker som tar sikte på å identifisere signatur molekyler (GM og β-glukan) fra sopp som sirkulerer i pasientens serum eller som er til stede i BAL væsker, sputum eller urinprøver 13. Selv om disse testene vise tilfredsstillende sensitivitet, de mangler tilstrekkelig spesifisitet eller lider av innblanding under visse forutsetninger 1,6 </sup>.
Den LFD test for IPA påvisning presenteres her gjør at "point-of-care" diagnose av IPA og utnytter teknologi som har blitt brukt hittil i tester for påvisning av virus, bakterier, parasitter og giftstoffer 14-19, og mest kjent, for hjemmelaget graviditetstester først introdusert av Unipath i 1988. I Aspergillus LFD beskrevet her, er Aspergillus-spesifikke MAB JF5 immobilisert til en fangst sone (testen linje) på en porøs nitrocellulose membran. Anti-mus immunoglobulin immobilisert til membranen i en egen sone fungert som en intern kontroll (kontroll linje). På tilsatt serum eller BAL væske til utgivelsen port, binder MAB JF5-kolloidalt gull konjugat i utgivelsen puten til målet antigen og komplekset deretter passerer langs den porøse membranen ved kapillærkraft. MAB JF5 immobilisert i capture sone bindes til JF5-kolloidalt gull-antigen komplekset som resulterer i en rød test linje. Enhver ubundet JF5-kolloidalt gullkonjugat binder seg til den interne kontrollen viser at analysen har kjørt riktig. Dette resulterer i en rød kontroll linje.
Testen er rask, tar bare 15 minutter å utføre, er billig i forhold til serum og BAL tester basert på GM og β-glukan deteksjon, og krever ikke dyrt utstyr eller store laboratorier for å kjøre. Videre er MAB JF5 ikke kryssreagerer med narkotika eller forurensninger som har vist seg å forårsake falskt positiv reaksjon i GM og β-glukan tester 1,4,6. En ekstra stor fordel fremfor dagens diagnostiske tester er LFDs evnen til å oppdage aktivitet som er et tegn på invasiv vekst av Aspergillus arter.
Et kritisk punkt i LFD prosedyren er behovet for å lese resultatene 15 minutter etter påføring av serum eller BAL prøven til enheten. Testen bør ikke stå lenger enn 15 min før du spiller inn resultatene, da dette kan skjevhet resultatet interpretatipå. En svak reaksjon vil ikke bli styrket ved å utvide inkubasjonstid. Varmebehandling av serum fra dyremodeller av infeksjon er funnet å forbedre analysen følsomhet. En begrensning av testen er at det er kvalitativ, og er avhengig av operatøren til å foreta en subjektiv vurdering av positivitet. Intensiteten av testen linjen varierer i henhold til antigen innholdet i serum og BAL prøver (Figur 1). Imidlertid indikerer noen positiv reaksjon (bestemt ved sammenligning til kjente negativer) tilstedeværelse av Aspergillus antigen og derfor infeksjon. For å begrense subjektivitet LFD analyser, håndholdte enheter er tilgjengelig tillate som kvantifisering av LFD testlinje intensiteter og muliggjøre etablering av grenseverdier for antigen påvisning 20.
Fremtidig utvikling av LFD inkludere kommersialisering og utvikling av en multiplex LFD som tillater samtidig påvisning av andre invasive soppbruker svært spesifikke mAbs tre.
The authors have nothing to disclose.
Tilskudd til Dr Thornton fra Pfizer Limited er takknemlig erkjent.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Aspergillus LFD | University of Exeter | Available from the corresponding author on request | |
RPMI-1640 | Sigma | R0883 | |
L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
Fetal calf serum | Biosera | S9100 | Other sources of fetal calf serum can be used in the preparation of TCM |
EDTA | Fisher Scientific | BPE120-1 |