Isolement et culture de cellules humaines fongiformes papilles gustatives
Summary
Nous avons cherché à élaborer un protocole reproductible pour isoler et de maintenir à long terme des cultures de cellules humaines fongiformes papilles gustatives. Les cellules de l'homme fongiformes papilles obtenus par biopsie ont été avec succès maintenues en culture pendant plus de huit passages (12 mois) sans perte de viabilité.
Abstract
Cellules gustatives sont très spécialisées, avec uniques histologiques, les caractéristiques moléculaires et physiologiques qui permettent la détection d'un large éventail de stimuli simples et molécules chimiques complexes contenus dans les aliments. Chez l'homme, fongiformes papilles individuelle contenir de zéro à un maximum de 20 papilles gustatives. Il n'ya pas de protocole établi pour la culture de cellules gustatives de l'homme, bien que la capacité à maintenir les cellules papilles gustatives de la culture pour les cycles cellulaires multiples serait d'une utilité considérable pour caractériser les propriétés moléculaires, de régénération, et fonctionnelles de ces cellules uniques sensoriels. Des études antérieures de cellules gustatives ont été effectuées en utilisant des cellules isolées fraîchement en culture primaire, des cultures d'explants de rongeurs, ou papilles semi-intactes dans des tranches de tissu 1,2,3,4. Bien que chacune de ces préparations a des avantages, le développement de cultures à long terme aurait apporté des avantages significatifs, en particulier pour les études de cellules gustatives prolifération et différenciation. Plusieurs groupes, dont le nôtre, ont été intéressés par le développement et la mise en place de modèles de culture de cellules gustatives. La plupart des tentatives de cellules gustatives de la culture ont rapporté la viabilité limitée, avec des cellules généralement pas durables au-delà de 3-5 D 5,6,7,8. Nous avons récemment présenté un rapport sur une méthode efficace pour la culture prolongée des cellules gustatives rongeurs 9. Nous rapportons ici pour la première fois la mise en place d'un système de culture in vitro pour les cellules isolées de l'homme fongiformes papilles gustatives. Les cellules de l'homme fongiformes papilles obtenus par biopsie ont été avec succès maintenues en culture pendant plus de huit passages (12 mois) sans perte de viabilité. Cellules affiché de nombreuses fonctionnalités moléculaires et physiologiques caractéristiques des cellules gustatives matures. Gustducin et la phospholipase C β2, (PLC-β2) ARNm ont été détectés dans de nombreuses cellules par réaction en chaîne par polymérase de la transcriptase inverse-et confirmé par séquençage. Analyse Immunocytochimie démontré la présence de rafales deexpression ducin et PLC-β2 dans les cellules gustatives culture. Des cultures de cellules humaines fongiformes également présenté des augmentations de calcium intracellulaire en réponse à des concentrations appropriées de stimuli gustatifs indiquant que plusieurs récepteurs du goût et au moins certains des voies de signalisation étaient présents. Ces résultats indiquent que suffisante cellules gustatives de l'homme adulte peut être générée et maintenue pendant au moins huit passages. Bon nombre des cellules conservent les caractéristiques physiologiques et biochimiques des cellules isolés de manière aiguë à partir de l'épithélium goût des adultes pour soutenir leur utilisation comme un système modèle de goût. Ce système permettra à d'autres études des processus impliqués dans la prolifération, la différenciation et la fonction de mammifères cellules réceptrices du goût dans une préparation de vitro.
Human papilles gustatives fongiformes utilisé pour établir une culture cellulaire humaine fongiformes ont été donnés pour la recherche après consentement éclairé appropriée en vertu des protocoles de recherche qui ont été examinéset approuvé par le comité de la CISR. Le protocole (# 0934) a été approuvé par les Associés Schulman Institutional Review Board Inc, Cincinnati, OH. Protocole écrit ci-dessous est basée sur des paramètres publiés rapportés par Özdener et al. 2011 10.
Protocol
Discussion
Nous avons maintenu les cellules obtenues à partir de papilles fongiformes goût humain depuis plus de 8 passages, couvrant une période de 12 mois. Ces cultures de générer de nouvelles cellules, dont beaucoup viennent à échéance in vitro à l'étape où ils expriment des marqueurs de plusieurs types de cellules matures goût de bourgeon, en plus de clés propriétés moléculaires et physiologiques de cellules réceptrices du goût. La présence de gustducin et PLC-β2 immunoréactivité en sous-ense…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Aimee Myers et Quayson Esi pour les compétences techniques et d'aide. Ce travail a été soutenu en partie par la NSF 0216310 et Givaudan Inc subvention de scolarisation (TNS).
Materials
| Name of the reagent | Company |
| MCDB 123 | Sigma-Aldrich |
| Iscove’s DMEM Medium | MediaTech |
| Elastase | Sigma-Aldrich |
| Pronase E | Sigma-Aldrich |
| Elastase | Worthington |
| Soy bean trypsin inhibitor | Worthington |
| Collagenase type 1 | Worthington |
| Rat tail collagen type 1 | BD Sciences |
| Fura-2 AM | Molecular Probes |
| Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen |
| Leica TCS SP2 Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems Inc. |
| Discovery-1 imaging station and Metamorph software | Molecular Devices |
| Small fine-tip forceps and extra fine spring scissors | Fine Science Tools |
References
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