L'analisi fenotipica e l'isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori
Summary
Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.
Abstract
Il midollo osseo è il luogo principale in cui CSE e più mature cellule progenitrici del sangue del lignaggio risiedono e di differenziarsi in un organismo adulto. CSE costituiscono una popolazione minuti cellulare delle cellule pluripotenti in grado di generare tutte le linee cellulari del sangue per una vita-time 1. La dissezione molecolare di omeostasi CSE nel midollo osseo ha importanti implicazioni in ematopoiesi, oncologia e medicina rigenerativa. Abbiamo descritto il protocollo etichettatura con anticorpi fluorescenti e la procedura gating elettronico in citometria a flusso per segnare sottoinsiemi progenitrici ematopoietiche e la distribuzione CSE in singoli topi (Fig. 1). Inoltre, si descrive un metodo per arricchire ampiamente progenitori emopoietici, nonché a lungo termine (LT) ed a breve termine (ST) ricostituire CSE da sospensioni di cellule del midollo osseo da un pool di arricchimento magnetico di cellule che esprimono c-Kit. Preparato cellulare risultante può essere utilizzato per ordinare sottoinsiemi selezionati in vitro ein vivo studi funzionali (Fig. 2).
Entrambi gli osteoblasti trabecolari 2,3 e 4 endotelio sinusoidale costituiscono nicchie funzionali di supporto CSE nel midollo osseo. Diversi meccanismi nella nicchia osteoblastica, tra cui un sottoinsieme di N-caderina + 3 osteoblasti e l'interazione del Tie2 tirosina chinasi del recettore espresso in CSE con il suo angiopoietina-1 ligando 5 concorrono nel determinare quiescenza CSE. "Ibernazione" nel midollo osseo è fondamentale per proteggere HSCs dalla replica e la stanchezza finale sull'attività ciclistica eccessiva 6. Stimoli esogeni che agiscono sulle cellule del sistema immunitario innato, come Toll-like ligandi del recettore 7 e interferone alfa-6 può anche indurre la proliferazione e la differenziazione di cellule staminali progenitori impegnati nel lignaggio. Recentemente, una popolazione di cellule staminali di topo dormienti all'interno del lin – c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 – CD34 – popolazione è stato descritto 8. Ordinamento delle cellule CD34 sulla base di un'espressione dalla ematopoietiche progenitori arricchita di sospensione cellulare come qui descritto permette l'isolamento di riposo sia auto-rinnovano LT-CSE e CSE ST-9. Una procedura simile basata su deplezione di cellule positive derivazione e smistamento di LT-HSC con CD48 e Flk2 anticorpi è stato precedentemente descritto 10. Nella presente relazione forniamo un protocollo per la caratterizzazione fenotipica ed ex vivo analisi del ciclo delle cellule di progenitori emopoietici, che possono essere utili per il monitoraggio ematopoiesi in diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Inoltre, si descrive un procedimento per FACS smistamento CSE, che possono essere utilizzati per definire fattori e meccanismi che regolano l'automantenimento, espansione e la differenziazione in biologia cellulare e saggi di trasduzione del segnale così come per il trapianto.
Protocol
Discussion
Il metodo qui descritto consente l'analisi rapida ed accurata di ematopoiesi in topi individuali (Figura 1). Questa analisi in diversi contesti sperimentali, inclusi i modelli murini di infiammazione, autoimmunità, immunodeficienza, malattie degenerative, malattie metaboliche e tumori, consente di indirizzare l'impatto delle condizioni patologiche su ematopoiesi. La Figura 3 mostra l'analisi di attività delle cellule ciclismo su LKS elettronicamente gated CD34…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa e Markus Manz per i preziosi consigli. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation svizzero, Lega svizzera contro il cancro e la Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| PenStrep | Gibco | 15070 |
| PBS | Gibco | 20012 |
| FBS | Gibco | 16000 |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
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