İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi
Summary
Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.
Abstract
Immünsupresif CD4 + düzenleyici T hücreleri (Tregs) geliştirilmesi ve bakım ve insan bedeni üzerinde kendini ve ortakçı antijenlerin büyük miktarda immünolojik homeostazisde kalmak için ihtiyaç duyulan periferik tolerans katkıda bulunur. Tregs ve inflamatuvar konvansiyonel T hücrelerinin arasındaki dengeye Pertürbasyonu İmmünopatolojiye veya kansere neden olabilir. Tregs terapötik enjeksiyon kolit, 1, tip I diyabet 2, romatoid artrit ve graft versus host hastalığı, insan karşı fare Treg biyolojisi 5 in 4 birkaç temel farklılıklar murin modellerinde etkili olduğu gösterilmiştir olmakla birlikte şimdiye kadar klinik kullanımı engellemiştir sahiptir. Yeterli sayıda, saflık, stabilite ve terapötik Tregs yuvalandırma özgüllük eksikliği kendi ex vivo genişlemesi 6 koşulları optimize etmek için hangi insan Treg gelişimi dinamik bir platformu gerektirmiştir.
Burada beğendimdört aşamadan ayrılabilir tek bir insan periferik kan donörden bağlı Tregs (iTregs) farklılaşması için bir yöntem escribe: periferik kan mononükleer hücreleri, CD4 manyetik seçimi + T hücre izolasyonu, in vitro hücre kültürü ve floresan aktive T hücre alt gruplarının hücre sıralama (FACS). Treg imza transkripsiyon faktörü forkhead kutusu P3 (FoxP3) insanlarda 7 aktivasyon bağlı transkripsiyon faktörü ve hiçbir diğer benzersiz belirteç var, damgalı bir kombinatoryal paneli baskılayıcı aktivite ile T hücrelerini tanımlamak için kullanılması gerekir beri. Kültüründe altı gün sonra, sistemindeki hücrelerin saf T hücreleri, CD25 ve CD45RA bunların bağıl ifade göre bellek T hücreleri veya iTregs içine olarak belirli edilebilir. Bellek ve naif T hücrelerinin farklı rapor kutuplaşma gereksinimleri ve plasticities 8 sahip olduğu gibi, CD45RA + ve CD45RO içine ilk T hücre popülasyonunun öncesi sıralama + alt kümeleri olabilir be bu farklılıklar incelemek için kullanılır. Diğerleri ile uyumlu olarak, bizim CD25 Hi CD45RA – FoxP3 9 iTregs ekspres yüksek düzeyde, GITR ve CTLA-4 11 ve CD127 12 düşük seviyelerde. Her nüfusun FACS ardından, elde edilen hücreler carboxyfluorescein süksinimidil ester (KAKE)-etiketli T hücrelerinin proliferasyonu otolog geciktirmek üzere göreli yeteneği hesaplayan bir bastırma deneyde kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Treg transferi, bunların verimli üretimi ve istikrarlı bakım yöntemleri otoimmünite rejeksiyon ve diğer immün veya inflamatuvar aracılı hastalıklar ile mücadelede çok büyük tedavi umut vaat ederken henüz geliştirilmiş değil. Insan T hücreleri dolaşımdaki sadece% 1-5 Tregs oldukları için kontrollü genişleme ve farklılaşma kliniğe Tregs uygulanması önemli bir caydırıcı olarak bu yetersizlik üstesinden gelir. Bu deneme TGN1412 13 öğrenilebilir gibi, diğer yandan, bu derece m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Falcon | 352008 | |
| 15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-368 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Falcon | 352059 | |
| 50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-364 | |
| Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | Gibco | 72400 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| 0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 40 μM Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
References
- Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
- Tarbell, K. V. Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).
- Morgan, M. E. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).
- Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 99, 3493-3493 (2002).
- Ziegler, S. F. FOXP3: of mice and men. Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).
- Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity. 30, 656-6565 (2009).
- Morgan, M. E. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Human Immunology. 66, 13-20 (2005).
- Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid. Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).
- McHugh, R. S. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, 311-323 (2002).
- Takahashi, T. Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4. The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).
- Liu, W. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).
- Schraven, B., Kalinke, U. CD28 superagonists: what makes the difference in humans. Immunity. 28, 591-595 (2008).
- Reneer, M. C. Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling. European Journal of Immunology. , (2011).
