Visualisation des vaisseaux coronaires est essentielle pour faire progresser notre compréhension des maladies cardio-vasculaires. Nous décrivons ici une méthode pour perfuser murin vasculaire coronaire avec un caoutchouc de silicone radio-opaque (Microfil), en préparation pour les micro-tomographie par ordinateur (μCT) d'imagerie.
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Article de méthode
Perfusion rétrograde et remplissage de la vascularisation coronaire souris comme préparation à l'imagerie par ordinateur Micro tomographie
Dans cet article
Résumé
Résumé
Visualisation de la vascularisation est de plus en plus important pour la compréhension de nombreux états pathologiques différentes. Bien que plusieurs techniques existent pour l'imagerie vasculaire, quelques-uns sont capables de visualiser le réseau vasculaire dans son ensemble tout en étendant à une résolution qui comprend le plus petit 1,2 navires. En outre, de nombreuses techniques de moulage vasculaires détruire les tissus environnants, ce qui empêche une analyse plus approfondie de l'échantillon 3-5. Une méthode qui contourne ces problèmes est la micro-tomographie par ordinateur (μCT). μCT imagerie permet de numériser à des résolutions de moins de 10 microns, est capable de produire des reconstitutions en 3D du réseau vasculaire, et laisse le tissu intact pour une analyse ultérieure (par exemple, l'histologie et la morphométrie) 6-11. Toutefois, les navires d'imagerie par des méthodes in vivo ex μCT exige que les navires soient remplies avec un composé radio-opaque. En tant que tel, la représentation précise de la vascularisation produite par μCT imagerie est subordonnée àremplissage fiable et complète des vaisseaux. Dans ce protocole, nous décrivons une technique pour remplir des récipients de souris coronaires en préparation pour l'imagerie μCT.
Deux techniques existent prédominent pour le remplissage du système vasculaire coronaire: in vivo par perfusion canulation et rétrograde de l'aorte (ou une branche hors de l'arche aortique) 12-14, ou ex vivo par l'intermédiaire d'un système de perfusion de Langendorff 15-17. Nous décrivons ici une méthode in vivo canulation aortique qui a été spécifiquement conçu pour assurer le remplissage de tous les navires. On utiliser un composé radio-opaque appelé faible viscosité Microfil qui peut perfuser à travers les petits vaisseaux pour remplir tous les capillaires, ainsi que deux des côtés artériels et veineux du réseau vasculaire. Les navires sont perfusées avec le tampon en utilisant un système de perfusion sous pression, puis rempli de Microfil. Pour veiller à ce que Microfil remplit les petits vaisseaux de résistance plus élevés, nous ligaturer les grosses branches emanating à partir de l'aorte, qui dévie le Microfil dans les artères coronaires. Une fois le remplissage terminé, pour empêcher la nature élastique du tissu cardiaque de serrage Microfil sur des vaisseaux, on ligature accessibles principaux points de sortie vasculaires immédiatement après le remplissage. Par conséquent, notre technique est optimisé pour un remplissage complet et la rétention maximale de l'agent de remplissage, permettant la visualisation de l'ensemble du réseau vasculaire coronaire - artères, les capillaires et les veines ressemblent.
Protocole
1. Préparatifs avant de commencer
- Remplir chaque côté de l'appareil de perfusion sous pression avec un tampon vasodilatateur (4 mg / L de papavérine + 1 g / L adénosine dans du PBS) ou paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS, respectivement.
- Préparer une seringue à insuline 1/2cc (avec un 29G fixé en permanence ½ "aiguille) en le remplissant avec 0,1 ml de 1:100 héparine (stock 5000U/ml) et de tordre l'aiguille à l'angle ~ 120 degrés avec le biseau vers le haut. Faites le même avec une seringue de 1 ml (avec une 26G ½ "aiguille) remplie avec 0,3 ml de solution de KCl saturé.
2. Exposer le cœur et l'a....
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Discussion
Tissu cardiaque a une très forte demande métabolique, et nécessite donc un apport constant de nutriments et d'oxygène dans le sang fourni par le système vasculaire coronarien. Maladies des vaisseaux coronaires, qui diminuent la fonction coronarienne en raison de sténose du vaisseau et le blocage, peuvent conduire à une hypoxie tissulaire et de l'ischémie, et de mettre les patients affectés au risque d'infarctus du myocarde et des dommages irréparables au muscle cardiaque. Une meilleure compréhension de l'.......
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Déclarations de divulgation
Les souris ont été traitées avec des méthodes approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de l'Université de Washington et en conformité avec le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par l'Institut national américain de la Santé (NIH Publication No. 85-23, révisée en 1996).
Remerciements
Nous remercions le Dr Kelly Stevens pour les essais initiaux du protocole, le Dr Michael Simons, Hauch Kip Dr, et les membres de leurs deux laboratoires pour la discussion générale.
Ce travail est le soutien par des subventions du NIH HL087513 et P01 HL094374.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Des seringues de 1 ml | Becton Dickinson | BD-309602 | |
| Des seringues à insuline 1/2cc avec des aiguilles 29G ½ fixé en permanence » | Becton Dickinson | BD-309306 | |
| 2 po x 2 po tampons de gaze | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾ "Angiocath IV cathéter | Becton Dickinson | BD-381112 | |
| 26G ½ aiguilles de calibre " | maigre "> Becton Dickinson | BD-305111 | |
| L'adénosine | Sigma | A9251 | 1g / L dans du PBS pour le tampon de vasodilatation (avec de la papavérine) |
| Pince Graefe angulaires | Outils belle science | 11052-10 | |
| Coton-tige: 6 "non-stérile | Cardinal Health | C15055-006 | |
| Courbes Ciseaux chirurgicaux | Outils belle science | 14085-09 | |
| Stéréoscope dissection et la source lumineuse | Nikon | NA | NA |
| Plateau de dissection, 11,5 x 7,5 pouces | Cole-Parmer | YO-10915-12 | Rempli avec du goudron pour mettre le doigt sur la souris |
| Beaux Forceps courbes | Aesculap | FD281R | Besoin de deux |
| L'héparine, 5000 U / ml de bouillon | APP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-047-10 | 1:100 de dilution dans l'eau |
| KCl | Pêcheur | P217 | Solution saturée dans H2O |
| Kétamine (Ketaset), 100 mg / ml de bouillon | Fort Dodge, Overland Park, KS, Etats-Unis | NDC 0856-2013-01 | Mélangé à 130 poids corporel mg / kg, avec xylazine à 0,9% saline |
| Microfil | Flow Tech | MV-122 (jaune). Autres options de couleur sont également disponibles. | Mélanger 1:1 en poids, avec 10% en volume d'agent de durcissement. Préparer juste avant l'injection, et le vortex pour s'assurer qu'il est bien mélangé |
| Non stérile Suture: 6-0, tressé de soie | Harvard Apparatus | 723287 | |
| Papavérine | American Regent Inc | NDC 0517-4010-01 | 4mg / L dans du PBS pour le tampon de vasodilatation (avec l'adénosine) |
| Paraformaldéhyde | Sigma | P6148 | Préparé comme solution à 4% |
| Appareil de perfusion | Voir la figure 2 | ||
| Ciseaux de printemps | Outils belle science | 15018-10 | |
| Xylazine (Anased), 20 mg / gl de stock | Labs Lloyd | NADA # 139-236 | Mélangé que 8,8 poids corporel mg / kg, avec la kétamine dans une solution saline à 0,9% |
Références
- Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease.
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Réimpressions et autorisations
