Количественные Визуализация Lineage конкретных Toll-подобный рецептор-опосредованной сигнализации в моноцитах и дендритных клеток из малых образцов крови человека
Summary
Мы описываем использование технологии ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Который сочетает в себе количественные проточной цитометрии с одновременным высоким разрешением цифрового изображения, количественно клеточных механизмов первичных иммунных клеток с четко определенной когорты пациентов. Наши исследования дают основой для поступательного исследования количественного линии специфический клеточный ответ в небольших образцов от субъекта когорт.
Abstract
Индивидуальные различия в иммунном статусе определить ответ на инфекцию и способствовать тяжести заболевания и результатов. Старение связано с повышенной восприимчивостью к вирусным и бактериальным инфекциям и снижение реакции на вакцины с хорошо документированной снижение гуморального и клеточного иммунного ответа 1,2. Недавно мы оценили эффект старения на Toll-подобных рецепторов (TLRs), ключевые компоненты иммунной системы, которые обнаруживают микробной инфекции и вызвать антимикробной защиты организма ответы 3. В большой группе здоровых человеческих доноров, мы показали, что моноцитов в периферической крови пожилых снизились выражения и функции определенных TLRs 4 и аналогичного снижения уровня TLR и сигнальные реакции в дендритные клетки (ДК), антиген-представляющих клеток, которые являются ключевыми в Связь между врожденного и адаптивного иммунитета 5. Мы показали, нарушение регуляции TLR3 в макрофагахд меньше, производство IFN по РС у пожилых доноров в ответ на инфицирование вирусом Западного Нила 6,7.
Первостепенное значение для нашего понимания иммунитета и для терапевтического вмешательства является глубокое понимание специфических типов клеток отвечать на запросы и механизм (ы) сигнала. Традиционные исследования иммунного ответа посредством визуализации первичных элементов и съемки маркеры ячейки FACS или иммуноблот продвинули наше понимание существенно, однако, эти исследования, как правило, ограничены технически малым объемом образца доступны пациентам и неспособностью проводить сложные лабораторные методы на нескольких человеческих образцов. ImageStream сочетает в себе количественные проточной цитометрии с одновременным высоким разрешением цифрового изображения и таким образом облегчает исследование в нескольких клеточных популяций одновременно для эффективного захвата пациента восприимчивости. Здесь мы демонстрируем использование ImageStream в ДК оценить TLR7 / 8опосредованной активации увеличение фосфорилирования и ядерной транслокации ключевым фактором транскрипции NF-kB, который инициирует транскрипцию множества генов, которые имеют важное значение для иммунной реакции 8. Используя эту технологию, мы также недавно продемонстрировали ранее не изменение TLR5 сигнализации и NF-kB в моноцитах путь от старых доноров, которые могут способствовать измененной иммунологической реактивности при старении 9.
Protocol
Discussion
Критические шаги в использовании ImageStream для поступательного исследования выбор соответствующих групп сравнения и оптимизации и проверки антител специфику. Различия между группами в теме помечены цель будет очевидным через гистограммы и клеточных изображений. В сочетании с тщательн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, а NCRR / GCRC программе M01-RR00125). Авторы заявляют не конкурирующие между собой финансовые интересы и поблагодарить д-р Марк Shlomchik, директор Сортировщик Йельского фонда Core Cell.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| BD Perm/Wash | BD Biosciences | 554723 |
| CD14-PE | eBioscience | 12-0149-41 |
| CD4-PacBlue | BD Pharmingen | 68436 |
| Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC | BD Biosciences | 340546 |
| CD11c-PE | BD Biosciences | 347637 |
| CD123-PE | BD Biosciences | 340545 |
| rabbit anti-NF-κB (p65) | SantaCruz | SC-372 |
| Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21246 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| ImageStream X | Amnis |
Table 1. Specific reagents and equipment.
| Cell type | FITC | PE | Alexa 647 | PacBlue |
| Monocyte | CD14 | NF-κB (p65) | ||
| mDC | Lin1 | CD11c | NF-κB (p65) | CD4 |
| pDC | Lin1 | CD123 | NF-κB (p65) | CD4 |
Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways
Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.
References
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
- Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
- van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
- Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
- Kong, K. -. F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
- Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. NF-kappaB in immunobiology. Cell research. 21, 223-244 (2011).
- Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
- George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).
