Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

Summary

Nous présentons une méthode pour former une fenêtre d'imagerie dans le crâne de la souris qui s'étend millimètres et est stable pendant des mois sans inflammation du cerveau. Cette méthode est bien adaptée pour les études longitudinales de la circulation sanguine, la dynamique cellulaire et cellulaire / structure vasculaire en utilisant la microscopie à deux photons.

Abstract

L'imagerie in vivo de la fonction corticale nécessite un accès optique au cerveau sans interruption de l'environnement intracrânienne. Nous présentons une méthode pour former un crâne poli et armé amincie (ports) fenêtre dans le crâne de la souris qui s'étend sur plusieurs millimètres de diamètre et est stable depuis des mois. Le crâne est amincie à 10 à 15 um d'épaisseur avec une perceuse à main pour réaliser une clarté optique, et est ensuite recouverte d'une colle cyanoacrylate et une vitre de protection à: 1) fournir une rigidité, 2) inhiber la repousse osseuse et 3) réduire la diffusion de la lumière des irrégularités sur la surface osseuse. Depuis le crâne n'est pas violé, une inflammation qui pourrait affecter le processus de l'étude est considérablement réduit. Des profondeurs d'imagerie allant jusqu'à 250 um en dessous de la surface corticale peut être réalisé en utilisant la microscopie biphotonique à balayage laser. Cette fenêtre est bien adapté pour étudier le débit sanguin cérébral et la fonction cellulaire dans les préparations à la fois anesthésiés et éveillés. Il offre en outre l'opportunity de manipuler l'activité des cellules à l'aide optogénétique ou d'interrompre le flux sanguin dans les vaisseaux ciblés par irradiation de la circulation photosensibilisants.

Protocol

1. Préparation pour la chirurgie ⁱ

1. Nettoyer les outils chirurgicaux par sonication dans un mélange de lait et de chirurgie Maxizyme dans un nettoyeur à ultrasons. Autoclaver les instruments chirurgicaux avant chaque expérience.
2. Veiller à ce que tous les réactifs nécessaires et consommables sont disponibles. Une liste des réactifs et consommables est fourni dans le tableau 2. Réactifs et consommables qui entrent en contact avec les tissus exposés doivent être stériles, lorsque cela est possible.
3. Induire une anesthésie. Anesthésiques typiques appropriés pour les études de survie sont décrites dans le tableau 1. Veiller à ce pla....

Discussion

Imagerie biphotonique à travers une fenêtre ports exige la transmission à travers l'os aminci et la dure-mère, ce qui atténue la lumière laser et ajoute des aberrations optiques à plus grande profondeur ^8. Cependant, malgré cet inconvénient, les profondeurs d'imagerie jusqu'à 250 um en dessous de la surface piale peut être atteint avec 900 nm d'excitation. Des profondeurs d'imagerie plus élevés peuvent en principe être possible avec des longueurs d'onde d'excitation plus ^13.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agent	Route de la livraison	Dose pour la souris	Durée	Remarques	Source	Ref Ref
Pentobarbital (Nembutal)	IP	90 pg / g	15-60 min	Marge de sécurité étroite. Travailler jusqu'à la dose appropriée de l'anesthésie lentement. Supplément de 10% de la dose d'induction selon les besoins.	036093; Butler Schein	7
La kétamine (Ketaset) mélangé avec xylazine (Anased)	IP	60 pg / g (K) 10 pg / g (X) (mélange dans une même seringue)	20-30 min	Xylazine est co-injecté comme relaxant musculaire et analgésique. Supplément que kétamine à 50% de la dose d'induction selon les besoins.	(K) 010177, (X) 033 198; Butler Schein	7
L'isoflurane (Isothesia)	Inhalation	4% de la concentration moyenne alvéolaire (MAC) pour l'induction, 1-2% de la MAC pour l'entretien	4-6 h.	À condition en mélange de l'oxygène 70% et 30% de protoxyde d'azote. L'anesthésie prolongée conduit à ralentir la récupération.	029403; Butler Schein	26

ARTICLE	SOCIÉTÉ	CATALOGUE # / MODÈLE
Betadine	Butler Schein	6906950
La buprénorphine (Buprenex)	Butler Schein	031919
Fluorescéine isothiocyanate dextrane, 2 MDa poids moléculaire	Sigma	FD2000S
L'alcool isopropylique	Pêcheur	AC42383-0010
Solution de lactate de Ringer	Butler Schein	009846;
Lidocaïne, 2% (v / v)	Butler Schein	002468
Saline	Butler Schein	009861
Lait chirurgicale	Butler Schein	014325
Rouge Texas dextrane, 70 kDa de poids moléculaire	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Butler Schein	035646
DISPOSABLES
Carbide bavures, taille de la pointe 1/2 mm	Outils belle science	19007-05
Applicateurs pointe pigé	Fisher Scientific	23-400-100
Couvercle en verre, pas. 0 épaisseur	Thomas scientifique	6661B40
La colle cyanoacrylate	Industries ND	31428 H04308
Époussetage à gaz	Newegg	N82E16848043429
Poudre de ciment Grip	Dentsply	675571
Ciment Grip solvant	Dentsply	675572
Seringue à insuline, 0,3 ml de volume avec 29,5 aiguille de la jauge	Butler Schein	018384
D'écrous et de boulons pour fixer la tête	Digikey	Nut, H723-ND; boulon, R2-56X1/4-ND
Pommade ophtalmique	Butler Schein	039886
Lames de bistouri	Fisher Scientific	12-460-448
Vis, autotaraudante # 000	JI Morris Company	FF000CE125
Silicone aquarium d'étanchéité	Perfecto Fabrication	31001
Poudre d'oxyde d'étain	Maman Minerals	EQT-TINOX
ÉQUIPEMENT
Scribe de verre	Fisher Scientific	08-675
Microscope à dissection	Carl Zeiss	OPMI-1 FC
Perceuse électrique alimenté	Foredom ou Osada	K.1020 (Foredom) ou EXL-M40 (Osada)
Rasoir électrique	Wahl	Série 8900
Forceps, Dumont ne. 55	Outils belle science	11255-20
Coussin chauffant Commentaires réglementé	FHC	40-90-8 (thermistor rectal, 40-90-5D-02; hmanger pad, 40-90-2-07)
Vaporisateur isoflurane	Ohmeda	IsoTec4
Oxymètre de pouls	Starr Sciences de la Vie	MouseOx
Tournevis, miniature	Garret Wade	26B09.01
Cadre stéréotaxique	Kopf Instruments	Modèle 900 (avec masque d'anesthésie de la souris et les non-rupture barres d'oreilles)
Ciseaux chirurgicaux, extrémité émoussée	Outils belle science	14078-10
Nettoyeur à ultrasons	Fisher Scientific	15-335-30