Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) à l'aide Drosophila Tissus
Summary
Récemment la technologie de séquençage à haut débit a considérablement augmenté la sensibilité de la chromatine immunoprécipitation (ChIP) expérience et son invité application à l'aide des cellules purifiées ou de tissus disséqués. Ici, nous délimiter une méthode pour utiliser la technique ChIP avec<em> Drosophila</emTissus>, qui peut traiter de l'état chromatine endogène dans un système bien caractérisé biologique.
Abstract
L'épigénétique reste un domaine en développement rapide qui étudie la façon dont l'Etat contribue à la chromatine expression différentielle des gènes dans des types cellulaires distincts à différents stades de développement. Régulation épigénétique contribue à un large éventail de processus biologiques, y compris la différenciation cellulaire au cours du développement embryonnaire et de l'homéostasie à l'âge adulte. Une stratégie essentielle dans les études épigénétiques est d'examiner comment diverses modifications des histones et des facteurs de la chromatine réguler l'expression génique. Pour résoudre ce problème, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est largement utilisé pour obtenir un instantané de l'association de facteurs particuliers avec de l'ADN dans les cellules d'intérêt.
Technique de ChIP utilise couramment des cellules en culture comme matériau de départ, qui peut être obtenu en abondance et d'homogénéité pour générer des données reproductibles. Cependant, il ya plusieurs mises en garde: Tout d'abord, l'environnement de cultiver des cellules dans les boîtes de Pétri est différente de celle in vivo, ce qui peutreflète pas l'état chromatine endogène des cellules dans un organisme vivant. Deuxièmement, tous les types de cellules peuvent être cultivées ex vivo. Il ya seulement un nombre limité de lignées cellulaires, à partir de laquelle les gens peuvent obtenir suffisamment de matériel pour le dosage ChIP.
Nous décrivons ici une méthode pour faire l'expérience en utilisant des tissus de Drosophila ChIP. Le matériau de départ est disséqué les tissus d'un animal vivant, ce qui peut refléter l'état chromatine endogène. L'adaptabilité de cette méthode avec beaucoup de différents types de tissus permettra aux chercheurs de répondre beaucoup plus biologiquement questions pertinentes relatives à la régulation épigénétique in vivo 1, 2. En combinant cette méthode avec séquençage à haut débit (ChIP-seq) sera en outre permettre aux chercheurs d'obtenir un paysage épigénomique.
Protocol
Discussion
La polyvalence des analyses ChIP abordés dans le présent protocole peut être utilisé sur différents tissus, qui prévoit la possibilité d'étudier l'état de la chromatine dans un système biologiquement pertinentes. Expériences utilisant des cellules de ChIP systèmes de culture sont commodes à réaliser parce que grande quantité de cellules peut être facilement obtenu. Cependant, les cellules cultivées ne reflètent pas nécessairement les cellules dans un environnement multi-cellulaire. En dévelop…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire du Dr Keji Zhao (NIH / NHLBI) pour leur aide dans la fourniture de résultats de séquençage. Nous aimerions également remercier le projet du génome UCSC pour l'utilisation de Genome Browser pour visualiser séquençage cartographié lit.
Ce travail a été soutenu par le Sentier de la R00HD055052 NIH pour Independence Award et R01HD065816 du NICHD, l'Lucile Parkard Fondation, et l'Université Johns Hopkins des fonds de démarrage pour XC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5′ exo–) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 |
|
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
