Kolonisatie van Euprymna scolopes Squid door Vibrio fischeri</em
Summary
De methode beschrijft de procedure waarmee de Hawaiiaanse bobtail inktvis,<em> Euprymna scolopes</em> En bacteriële symbiont,<em> Vibrio fischeri</em>, Afzonderlijk en vervolgens verhoogd ingevoerd voor het specifieke kolonisatie van de inktvis licht orgel door de bacteriën. Kolonisatie detectie door bacterieel afgeleide luminescentie en door directe kolonie tellen worden beschreven.
Abstract
Specifieke bacteriën worden gevonden in samenwerking met dierlijk weefsel 1-5. Deze host-bacteriële verenigingen (symbiose) kunnen schadelijk zijn (pathogene), hebben geen fitness gevolg (commensale), of nuttig zijn (mutualistische). Hoewel veel aandacht is besteed aan pathogene interactie, is er weinig bekend over de processen die de reproduceerbare overname van nuttige / commensale bacteriën uit de omgeving bepalen. Het licht-orgel mutualisme tussen het mariene Gram-negatieve bacterie V. fischeri en de Hawaiiaanse bobtail squid, E. scolopes, staat voor een zeer specifieke interactie waarbij een host (E. scolopes) een symbiotische relatie met slechts een bacteriesoort (V. fischeri) in de loop van de levensduur van 6,7. Bioluminescentie door V. fischeri tijdens deze interactie geeft een anti-agressieve voordeel E. scolopes tijdens nachtelijke activiteit 8,9, terwijlde voedselrijke gastheerweefsel biedt V. fischeri met een beschermde nis 10. Tijdens elke host generatie, wordt deze relatie samengevat, zodat aan een voorspelbaar proces dat kan in detail worden beoordeeld in verschillende stadia van symbiotische ontwikkeling. In het laboratorium, de jeugdige inktvis luik aposymbiotically (uncolonized), en, indien verzameld binnen de eerste 30-60 minuten en overgebracht naar symbiont-vrij water, kan niet worden gekoloniseerd, behalve door de experimentele inoculum 6. Deze interactie geeft een nuttig modelsysteem waarin de afzonderlijke stappen die leiden tot de specifieke verkrijging van een microbe symbiotische uit de omgeving 11,12 beoordelen.
Hier beschrijven een werkwijze om de mate van kolonisatie die optreedt wanneer pasgeboren aposymbiotic E. beoordelen scolopes worden blootgesteld aan (kunstmatige) zeewater met V. fischeri. Deze eenvoudige test beschrijft inenting, een natuurlijke infectie, en herstelvan de bacteriële symbiont van de ontluikende lichtorgel van E. scolopes. Er wordt op een consistente omgeving voor de dieren tijdens het symbiotische ontwikkeling, in het bijzonder met betrekking tot de kwaliteit van het water en licht signalen. Methoden om de beschreven symbiotische bevolking kenmerken omvatten (1) meting van bacterieel afgeleid bioluminescentie, en (2) directe kolonie tellen van teruggewonnen symbionten.
Protocol
Discussion
De beschreven kolonisatie assay maakt analyse van een natuurlijk proces symbiotische in een gecontroleerde laboratorium. Als zodanig kan worden gebruikt om kolonisatie beoordelen door mutante stammen door verschillende natuurlijke isolaten en onder verschillende chemische regimes. Variaties op de beschreven experimenten worden vaak gebruikt om verschillende aspecten van de symbiose te beoordelen. De kinetiek van de kolonisatie kan worden gemeten door behandeling luminescentie tijdens de eerste 24 uur, die automatisch ku…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Mattias Gyllborg voor inktvis facilitaire ondersteuning en voor reacties op dit manuscript, Michael Hadfield en de Kewalo Marine Laboratory voor hulp tijdens de veld verzamelen, en leden van de Ruby en McFall-Ngai Laboratorium voor bijdragen aan dit protocol. Werk in de Mandel Laboratorium wordt ondersteund door NSF IOS-0843633.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
