Células endoteliales Co-cultura media la maduración de embriones humanos de células madre a las células productoras de insulina del páncreas en un enfoque de diferenciación dirigida
Summary
El estudio actual describe un enfoque de diferenciación dirigida en la inducción de diferenciación pancreática de células madre embrionarias humanas. De gran importancia es la constatación de que las células endoteliales de co-cultivo de maduración media de las células madre embrionarias derivan en células progenitoras pancreáticas de insulina que expresan.
Abstract
Las células madre embrionarias (ESC) tienen dos características principales: pueden ser propagadas de vitro indefinidamente en un estado indiferenciado y que son pluripotentes, lo que tiene el potencial de diferenciarse en múltiples linajes. Estas propiedades hacen que CES sumamente atractiva para la terapia celular regenerativa y aplicaciones basadas en el tratamiento 1. Sin embargo, para todo su potencial para llevarse a cabo las células que se diferencian en fenotipos maduros y funcionales, que es una tarea de enormes proporciones. Un enfoque prometedor en la inducción de diferenciación celular es para imitar el camino de la organogénesis en el en el establecimiento in vitro. El desarrollo del páncreas se sabe que se producen en etapas específicas 2, a partir del endodermo, que pueden desarrollarse en varios órganos, incluyendo el hígado y el páncreas. Endodermo inducción se puede lograr por la modulación de la vía nodal mediante la adición de activina A 3 en combinación con varios factores de crecimiento 4-7 </sup>. Células definitivas endodermo luego someterse compromiso pancreático por inhibición de la inhibición sónica erizo, lo cual puede lograrse in vitro mediante la adición de ciclopamina 8. Maduración de páncreas está mediada por varios eventos paralelos, que incluyen la inhibición de la muesca de señalización; agregación de células progenitoras pancreáticas en 3-dimensionales racimos; inducción de la vascularización; para nombrar unos pocos. Con mucho, el más exitoso en la maduración in vitro de células derivadas de CES pancreáticas progenitoras se han logrado a través de la inhibición de la señalización Notch por la suplementación DAPT 9. Aunque tuvo éxito, esto da como resultado un bajo rendimiento del fenotipo maduro con funcionalidad reducida. Un área menos estudiada es el efecto de la señalización de las células endoteliales en la maduración de páncreas, que es cada vez más apreciado como un factor importante que contribuye a la maduración in vivo los islotes pancreáticos 10,11.
El presente estudio explora estos efectos de endotelioial de señalización celular en la maduración de los humanos derivados de la CES, las células pancreáticas productoras de insulina en progenitoras de los islotes, como las células. Se presenta un protocolo de múltiples etapas de diferenciación dirigida, donde los humanos CES primero se induce hacia endodermo por activin A junto con la inhibición de la vía PI3K. Especificación de las células de páncreas endodermo se logra mediante la inhibición de la señalización erizo sónico por ciclopamina junto con la inducción de retinoide por adición de ácido retinoico. La etapa final de la maduración es inducida por la señalización de las células endoteliales consigue una configuración de co-cultivo. Mientras que varias células endoteliales han sido probados en el co-cultivo, en este documento se presentan los datos con las células de rata microvasculares endoteliales del corazón (RHMVEC), principalmente por la facilidad de análisis.
Protocol
Discussion
Durante el desarrollo del páncreas, que diferencian las células pancreáticas están en estrecha proximidad con las células endoteliales de la aorta y, además, los islotes pancreáticos son densamente vascularizado para promover el intercambio rápido de glucosa en la sangre y las hormonas de los islotes. Teniendo en cuenta estos hechos, no es sorprendente que las células endoteliales juegan un papel importante en el proceso de organogénesis pancreática. Si bien la importancia de las células endoteliales durante…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el apoyo de los NIH Premio Innovador Nueva DP2 116520 y ORAU Ralph Powe Premio Junior Faculty mejora.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Concentrations |
| mTeSR1 (with supplement) | Stem cell Technologies | 5850 | |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131 (Complete) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | 100ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| All-Trans Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
| EGF | R&D | 236-EG | 10ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey Nagel | 740955 | |
| ImProm II reverse transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR Green QPCR master mix | Straragene | 600548 | |
| Sox17 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-17355 | 1/500 |
| PDX1 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-14662 | 1/500 |
| C-Peptide Rabbit polyclonal | Cell Signaling | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
Table 2. Reagents and Kits.
References
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