TransFLP - Een methode om genetisch te modificeren<em> Vibrio cholerae</em> Op basis van Natural Transformation en FLP-recombinatie

Summary

Een snelle methode om het genoom ervan te wijzigen<em> V. cholerae</em> Beschreven. Deze aanpassingen behoort het schrappen van enkele genen, gen clusters en genomische eilanden en de integratie van de korte sequenties (bijv. promotor elementen of affiniteit-tag sequenties). De methode is gebaseerd op het natuurlijke transformatie en FLP-recombinatie.

Abstract

Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor manipuleren bacteriële chromosomen ^1-3. De meeste van deze protocollen gebaseerd op het inbrengen van conditioneel replicerende plasmiden (bijv. herbergen pir-afhankelijke of temperatuurgevoelige replicons ^1,2). Deze plasmiden geïntegreerd in bacteriële chromosomen basis van homologie-gemedieerde recombinatie. Dergelijke insertie mutanten zijn vaak direct gebruikt in experimentele settings. Als alternatief kan selectie voor plasmide excisie gevolgd door het verlies worden uitgevoerd, die voor Gram-negatieve bacteriën berusten vaak op de teller instelbare levansucrase enzym gecodeerd door het sacB gen ^4. De excisie kan herstellen vóór het inbrengen genotype of resulteren in een uitwisseling tussen het chromosoom en het plasmide-gecodeerde kopie van het gemodificeerde gen. Een nadeel van deze techniek is dat het tijdrovend. Het plasmide moet eerst worden gekloneerd, het vereist horizontale overdracht V. cholerae (n meeste otably door paring met een E. coli donor stam) of kunstmatige transformatie van de laatste, en de excisie van het plasmide is willekeurig en kan het herstel van de oorspronkelijke genotype of maak de gewenste wijzigingen als er geen positieve selectie wordt uitgeoefend. Hier geven we een werkwijze voor snelle manipulatie van de V. cholerae chromosoom (en) ⁵ (figuur 1). Deze TransFLP methode is gebaseerd op de recent ontdekte chitine-gemedieerde inductie van natuurlijke deskundigheid op dit organisme ⁶ en andere representatieve van het geslacht Vibrio zoals V. fischeri ^7. Natuurlijke competentie maakt de opname van vrij DNA waaronder PCR-gegenereerde DNA-fragmenten. Eenmaal opgenomen, de DNA recombineert met het chromosoom gezien de aanwezigheid van een minimum van 250-500 bp flankerend homoloog gebied ^8. Inclusief een selectiemerker in-tussen deze flankerende gebieden maakt een eenvoudige detectie van veel voorkomende transformanten.

t "> Deze methode kan worden gebruikt voor verschillende genetische manipulatie van V. cholerae en mogelijk ook andere natuurlijk competente bacteriën. We geven drie nieuwe voorbeelden van wat kan worden bereikt door deze methode naast onze eerder gepubliceerde studie in enige gendeleties en de toevoeging van affiniteit-tag sequenties ^5. Verschillende optimalisatie stappen met betrekking tot de initiële protocol van chitine-geïnduceerde natuurlijke transformatie ⁶ zijn opgenomen in dit TransFLP protocol. Hieronder vallen onder andere de vervanging van krab schelp fragmenten door in de handel verkrijgbare chitine vlokken ^8, de donatie van PCR afgeleide DNA omzetmaterialen ⁹ en de toevoeging van FLP-recombinatie doelplaatsen (FRT) ^5. FRT er rekening plaatsgerichte excisie van de selectiemerker gemedieerd door de Flp recombinase ^10.

Protocol

De TransFLP methode (figuur 1) wordt geïllustreerd door drie verschillende benaderingen: I) het schrappen van twee aangrenzende genen die coderen virulentiedeterminanten van V. cholerae (bijvoorbeeld ΔctxAB), II) het verwijderen van een eiland pathogeniteit (bijvoorbeeld ΔVPI-1) en III) de integratie van een T7 RNA polymerase promoter-afhankelijke sequentie stroomopwaarts van een gen van belang, dat vervolgens kan de kunstmatige expressie in de respectieve stam achtergrond (bijv…

Representative Results

Representatieve resultaten van de drie voorbeelden worden getoond in figuren 4 tot 6. De eerste benadering die gericht zijn op het verwijderen van de naburige genen ctxA en ctxB. Samen coderen belangrijke virulentiefactor van V. cholerae choleratoxine. We ontwierpen oligonucleotiden voor de TransFLP werkwijze zoals boven beschreven en volgens figuur 3. De parentale stam, werden de tussenliggende stam die de FRT-geflankeerd antibioticaresistentie cassette in de…

Discussion

De TransFLP hierboven beschreven werkwijze en elders ⁵ veelvuldig gebruikt in ons laboratorium. Het soort genetische manipulaties die haalbaar zijn onder andere: deletie van enkele genen en clusters, deletie van genomische eilanden (bijv. VPI-1), insertie van sequenties stroomopwaarts van een gen van belang (bijvoorbeeld, promotersequenties) en insertie van sequenties aan het einde van een specifiek gen (bijvoorbeeld coderend affinity tags).

Een import v…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Chitin flakes	Sigma	C9213	Autoclaving required
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp)	Biorad	165-2100	Or comparable electroporators