TransFLP - Une méthode pour modifier génétiquement<em> Vibrio cholerae</em> Basé sur la transformation naturelle et FLP-recombinaison

Summary

Une méthode rapide pour modifier le génome d'<em> V. cholerae</em> Est décrite. Ces modifications incluent la suppression de gènes uniques, des clusters de gènes et îlots génomiques ainsi que l'intégration de séquences courtes (par exemple des éléments de promoteur ou par affinité tag séquences). La méthode est basée sur la transformation physique et FLP-recombinaison.

Abstract

Plusieurs méthodes sont disponibles pour manipuler les chromosomes bactériens ^1-3. La plupart de ces protocoles reposent sur ​​l'insertion des plasmides réplicatifs conditionnelle (par exemple abriter des réplicons pir-dépendants ou sensibles à la température ^1,2). Ces plasmides sont intégrés dans les chromosomes bactériens basés sur l'homologie médiée par recombinaison. Ces mutants d'insertion sont souvent utilisés directement dans des cadres expérimentaux. En variante, la sélection pour l'excision du plasmide suivie par la perte peut être effectuée, pour laquelle les bactéries Gram négatif dépend souvent de l'enzyme contre-sélectionnable sucrase lévane codée par le gène sacB ^4. L'excision pouvez restaurer le génotype de pré-insertion ou le résultat d'un échange entre le chromosome et la copie plasmidique du gène modifié. Un inconvénient de cette technique est qu'elle prend beaucoup de temps. Le plasmide doit être cloné premier, il nécessite de transfert horizontal V. cholerae la plupart (n otably par accouplement avec un E. coli souche donneuse) ou artificielle transformation de celui-ci, et l'excision du plasmide est aléatoire et peut soit restaurer le génotype initial ou créer la modification souhaitée si aucune sélection positive est exercée. Ici, nous présentons une méthode pour la manipulation rapide de l'V. chromosome cholerae (s) ⁵ (figure 1). Cette méthode est basée sur TransFLP la chitine récemment découvert à médiation par induction de compétence naturelle dans cette organisme représentatif ⁶ et d'autre du genre Vibrio tels que V. fischeri ^7. Compétence naturelle permet l'absorption de l'ADN libre, y compris des fragments d'ADN générés par PCR. Une fois pris, l'ADN recombine avec le chromosome étant donné la présence d'un minimum de 250-500 pb de la région flanquante homologue ^8. Comprenant un marqueur de sélection entre-deux de ces régions adjacentes permet une détection facile des transformants fréquentes.

t "> Cette méthode peut être utilisée pour différentes manipulations génétiques de V. cholerae et potentiellement d'autres bactéries naturellement compétentes. Nous fournissons trois exemples de nouvelles sur ce qui peut être accompli par cette méthode, en plus de notre étude précédemment publiée sur les suppressions monogéniques et le plus d'affinité tag séquences ^5. Plusieurs étapes d'optimisation concernant le protocole initial de la chitine induite par la transformation naturelle ⁶ sont intégrés dans le présent protocole TransFLP. Ceux-ci comprennent entre autres le remplacement des fragments de coquilles de crabe en flocons disponible dans le commerce chitine ^8, le don de la PCR dérivée d'ADN transformant en matériau ^9, et l'ajout de sites cibles FLP-FRT recombinaison () ^5. sites FRT permettre l'excision dirigée vers le site du marqueur de sélection par l'intermédiaire de la recombinase Flp ^10.

Protocol

La méthode TransFLP (figure 1) est illustrée par trois approches différentes: I) la suppression de deux gènes adjacents codant pour des déterminants de virulence de V. cholerae (par exemple, ΔctxAB), ii) l'élimination d'un îlot de pathogénicité (par exemple, ΔVPI-1), et iii) l'intégration d'une séquence T7 polymérase dépendante de l'ARN promoteur en amont d'un gène d'intérêt, ce qui permet par la suite de son expression artificiell…

Representative Results

Les résultats représentatifs des trois exemples sont présentés dans les figures 4 à 6. La première approche vise à supprimer les gènes voisins ctxA et ctxB. Ensemble, ils codent le facteur de virulence majeur de V. cholerae, la toxine cholérique. Nous avons conçu des oligonucléotides pour la méthode TransFLP comme décrit ci-dessus et conformément à la figure 3. La souche parentale, la souche intermédiaire hébergeant FRT de la cassette de rési…

Discussion

La méthode décrite ci-dessus et TransFLP ailleurs ⁵ a été largement utilisée dans notre laboratoire. Le genre de manipulations génétiques qui sont réalisables comprennent entre autres: la suppression de gènes individuels et groupes de gènes, la suppression des îlots génomiques (par exemple, VPI-1), l'insertion de séquences en amont d'un gène d'intérêt (par exemple, des séquences promotrices) et l'insertion de séquences à la fin d'un gène spécifique (p…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Chitin flakes	Sigma	C9213	Autoclaving required
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp)	Biorad	165-2100	Or comparable electroporators