TransFLP - un metodo per modificare geneticamente<em> Vibrio cholerae</em> Sulla base di trasformazione naturale e FLP-ricombinazione

Summary

Un metodo rapido per modificare il genoma di<em> V. cholerae</em> È descritto. Queste modifiche includono la cancellazione dei singoli geni, i cluster di geni e le isole genomiche, nonché l'integrazione di brevi sequenze (ad esempio, elementi promotori o per affinità tag sequenze). Il metodo si basa sulla trasformazione naturale e FLP-ricombinazione.

Abstract

Sono disponibili diversi metodi per manipolare cromosomi batterici ^1-3. La maggior parte di questi protocolli invocare l'inserimento di plasmidi replicativi condizionale (es. ospitano repliconi pir-dipendenti ovvero termosensibili ^1,2). Questi plasmidi sono integrati in cromosomi batterici basati su omologia-mediata ricombinazione. Tali mutanti inserzionali sono spesso direttamente utilizzati in contesti sperimentali. In alternativa, la selezione per escissione plasmide seguita dalla perdita può essere eseguita, per cui batteri Gram-negativi dipende spesso contro-selezionabile enzimatico saccarasi Levan codificata dal gene sacB ^4. L'escissione può ripristinare il pre-inserimento genotipo o provocare uno scambio tra il cromosoma e il plasmidica copia del gene modificato. Uno svantaggio di questa tecnica è che richiede tempo. Il plasmide deve essere clonato prima, richiede trasferimento orizzontale in V. cholerae la maggior parte (n otably con l'accoppiamento con una E. coli ceppo donatore) o trasformazione artificiale di quest'ultimo, e l'escissione del plasmide è casuale e può ripristinare il genotipo iniziale o creare la modifica desiderata in assenza di selezione positiva viene esercitata. Qui, presentiamo un metodo per la manipolazione rapida V. cholerae cromosoma (s) ⁵ (Figura 1). Questo metodo TransFLP si basa sulla recente scoperta chitina-mediata induzione di competenza naturale in questo organismo rappresentativo ⁶ e altri del genere Vibrio come V. fischeri ^7. Competenza naturale permette l'assunzione di DNA libero tra cui PCR generati frammenti di DNA. Una volta assunto, il DNA ricombina con il cromosoma data la presenza di un minimo di 250-500 bp fiancheggianti della regione omologa ^8. Compreso un marcatore di selezione in-tra le regioni a fianco permette la facile individuazione dei trasformanti frequenti.

t "> Questo metodo può essere utilizzato per diverse manipolazioni genetiche V. cholerae e batteri naturalmente competenti potenzialmente anche altri. Forniamo tre esempi nuovi su ciò che può essere realizzato con questo metodo, oltre al nostro studio precedentemente pubblicato sul gene delezioni singole e la aggiunta di affinità-tag sequenze ^5. procedura di ottimizzazione in materia di protocollo iniziale di chitina-trasformazione indotta naturale ⁶ sono incorporati nel presente protocollo TransFLP., tra cui tra l'altro la sostituzione di frammenti di conchiglie granchio disponibile in commercio da chitina fiocchi ^8, la donazione di PCR derivato da DNA trasformante materiale ^9, e l'aggiunta di FLP-ricombinazione siti bersaglio (FRT) ^5. siti FRT consentono escissione sito-diretta del marcatore di selezione mediata dalla ricombinasi Flp ^10.

Protocol

Il metodo TransFLP (Figura 1) è esemplificato da tre diversi approcci: I) la delezione di due geni adiacenti codificano determinanti di virulenza di V. cholerae (ad esempio, ΔctxAB), II), la rimozione di un'isola patogenicità (ad esempio, ΔVPI-1) e iii) l'integrazione di una sequenza polimerasi dipendente dal promotore T7 RNA monte di un gene d'interesse, che consente successivamente il suo espressione artificiale in background ceppo corrispondente (ad esempio, T7-T…

Representative Results

Risultati rappresentativi di tre esempi sono mostrati nelle figure 4 a 6. Il primo approccio volto a eliminare i geni vicini ctxA e ctxB. Insieme codificare il principale fattore di virulenza V. cholerae, tossina del colera. Abbiamo progettato oligonucleotidi per il metodo TransFLP come sopra descritto e secondo la figura 3. Il ceppo parentale, il ceppo intermedio ospitare la FRT-fiancheggiato cassetta antibiotico resistenza al locus DNA originale ctxAB</e…

Discussion

Il metodo sopra descritto TransFLP e altrove ⁵ è stato ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio. Il tipo di manipolazioni genetiche che sono fattibili includono tra gli altri: delezione di geni singoli e gruppi di geni, delezione di isole genomiche (es., VPI-1), l'inserimento di sequenze a monte di un gene di interesse (ad esempio, sequenze promotore) ed inserimento di sequenze alla fine di un gene specifico (ad esempio, codifica tag di affinità).

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Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Chitin flakes	Sigma	C9213	Autoclaving required
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp)	Biorad	165-2100	Or comparable electroporators