TransFLP - en metode for å genmodifisere<em> Vibrio cholerae</em> Basert på Natural Transformation og FLP-rekombinasjon

Summary

En rask metode for å modifisere genomet<em> V. cholerae</em> Er beskrevet. Disse endringene omfatter sletting av enkeltgener, Gene klynger og genomisk øyer samt integrering av korte sekvenser (f.eks promoter elementer eller affinitet-tag sekvenser). Metoden er basert på den naturlige transformasjon og FLP-rekombinasjon.

Abstract

Flere metoder er tilgjengelige for å manipulere bakterielle kromosomer ^1-3. De fleste av disse protokollene avhengige innsetting av betinget replicative plasmider (f.eks harboring PIR-avhengige eller temperaturfølsom replikoner ^1,2). Disse plasmider er integrert i bakterielle kromosomer basert på homologi-mediert rekombinasjon. Slike innsettingen mutanter er ofte brukt direkte i eksperimentelle innstillinger. Alternativt kan valget for plasmid eksisjon etterfulgt av sitt tap utføres, som for Gram-negative bakterier ofte avhengig telleren-valgbar Levan sukrase enzym kodet av genet SACB ^4. Excision kan enten gjenopprette pre-innsetting genotype eller resulterer i en utveksling mellom kromosomet og plasmidet-kodede kopi av den modifiserte genet. En ulempe med denne teknikken er at det er tidkrevende. Plasmidet har å bli klonet først, det krever horisontal overføring inn V. cholerae (mest n otably av parring med en E. coli donor stamme) eller kunstig transformasjon av sistnevnte, og den excision av plasmidet er tilfeldig og kan enten gjenopprette det opprinnelige genotype eller skape ønsket modifikasjon hvis ingen positiv utvelgelse utøves. Her presenterer vi en fremgangsmåte for hurtig manipulering av V. cholerae kromosom (er) ⁵ (figur 1). Dette TransFLP metoden er basert på den nylig oppdagede chitin-mediert induksjon av naturlig kompetanse i denne organismen ⁶ og annen representant av slekten Vibrio eksempel V. fischeri ^7. Naturlig kompetanse tillater opptaket av fritt DNA inkludert PCR-genererte DNA-fragmenter. Gang tatt opp, recombines DNA med kromosomet gitt nærvær av et minimum av 250-500 bp av flankeangrep homologe område ^8. Inkludert et utvalg markør i mellom disse flanking regionene gjør det enkelt påvisning av hyppig forekommende transformanter.

t "> Denne metoden kan brukes for ulike genetiske manipulasjoner av V. cholerae og potensielt også andre naturlig kompetente bakterier. Vi gir tre nye eksempler på hva som kan oppnås ved denne metode i tillegg til vår tidligere publisert studie på enkelt gen slettinger og tillegg av affinitet-tag sekvenser ^5. Flere optimalisering trinn om den første protokollen av kitin-indusert naturlig transformasjon ⁶ inngår i denne TransFLP protokollen. Disse inkluderer blant annet utskifting av krabbe shell fragmenter av kommersielt tilgjengelige kitin ⁸ flak, donasjon av PCR -derived DNA som transformere materiale ^9, og tillegg av FLP-rekombinasjon målwebområder (FRT) ^5. FRT nettsteder lar seterettet excision av seleksjonsmarkør mediert av Flp recombinase ^10.

Protocol

Den TransFLP metoden (figur 1) er eksemplifisert ved tre forskjellige metoder: I) sletting av to tilstøtende gener koder virulens determinanter av V. cholerae (f.eks ΔctxAB), ii) fjerning av en sykdomsfremkallende øy (f.eks ΔVPI-1), og III) integrering av en T7 RNA-polymerase-avhengige promotor sekvensen oppstrøms av et gen-av-interesse, som senere lar sine kunstig uttrykk i den respektive stamme bakgrunn (f.eks, T7-tfoX) (Figur 2). <p class="jove_tit…

Representative Results

Representative resultater av de tre eksempler er vist på fig 4-6. Den første tilnærmingen rettet mot å slette de nærliggende gener ctxA og ctxB. Sammen har de koder den store virulens faktor V. cholerae, koleratoksin. Vi designet oligonukleotider for TransFLP metoden som beskrevet ovenfor og i henhold til figur 3. Foreldrenes belastning, ble den mellomliggende belastning harboring FRT-flankert antibiotikaresistens kassett på det opprinnelige DNA locus av…

Discussion

Den TransFLP metoden beskrevet ovenfor, og andre steder ⁵ har vært mye brukt i vårt laboratorium. Den slags genetiske manipulasjoner som er gjennomførbare inkluderer blant annet: sletting av enkle gener og gen klynger, sletting av genomisk øyer (f.eks VPI-1), innsetting av sekvenser oppstrøms av et gen av interesse (for eksempel promoter sekvenser) og innsetting av sekvenser på slutten av et bestemt gen (f.eks koding affinitet tags).

En import foru…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Chitin flakes	Sigma	C9213	Autoclaving required
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp)	Biorad	165-2100	Or comparable electroporators