TransFLP - um método para modificar geneticamente<em> Vibrio cholerae</em> Com base Transformação Natural e recombinação FLP-

Summary

Um método rápido para modificar o genoma de<em> V. cholerae</em> É descrito. Essas modificações incluem a eliminação de genes individuais, grupos de genes e ilhas genômicas, bem como a integração de seqüências curtas (por exemplo, elementos promotor ou afinidade tag-seqüências). O método baseia-se na transformação de recombinação natural e FLP.

Abstract

Vários métodos estão disponíveis para manipular cromossomas bacterianos ^1-3. A maior parte destes protocolos contar com a inserção de plasmídeos replicativos condicionalmente (por exemplo, abrigando replicões pir-dependentes ou sensíveis à temperatura ^1,2). Estes plasmídeos são integrados nos cromossomas bacterianos com base na homologia mediada por recombinação. Esses mutantes de inserção são muitas vezes usado diretamente em ambientes experimentais. Em alternativa, a selecção para a excisão do plasmídeo seguido por sua perda pode ser realizada, que para bactérias gram-negativas depende frequentemente da enzima sucrase contra-seleccionável de levana, codificada pelo gene sacB ^4. A excisão pode restaurar o genótipo de pré-inserção, ou em resultado de uma troca entre o cromossoma e a cópia mediada por plasmídeos do gene modificado. Uma desvantagem desta técnica é que é demorado. O plasmídeo tem que ser clonado primeiro, que exige a transferência horizontal em V. cholerae (mais n otably por acasalamento com um E. coli estirpe dadora) ou transformação artificial deste último, e da excisão do plasmídeo é aleatório e pode restaurar o genótipo inicial ou criar a modificação desejada se nenhuma selecção positiva é exercida. A seguir, apresentamos um processo para a manipulação rápida da V. cholerae cromossoma (s) ⁵ (Figura 1). Este método TransFLP baseia-se na descoberta recentemente indução mediada por quitina de competência natural nesse organismo representativo ⁶ e outros do género, tais como Vibrio V. fischeri ^7. Competência natural permite a captação de ADN livre, incluindo fragmentos de PCR gerados pelo DNA. Uma vez absorvido, o ADN recombina com o cromossoma, dada a presença de um mínimo de 250-500 pb da região flanqueadora homólogo ^8. Incluindo um marcador de selecção de entre estas regiões flanqueadoras permite a fácil detecção de transformantes que ocorrem com frequência.

t "> Este método pode ser usado para diferentes manipulações genéticas de V. cholerae e potencialmente também outras bactérias naturalmente competentes. Fornecemos três exemplos novos do que pode ser conseguida por este método, além do nosso estudo publicado anteriormente em deleções de um único gene e do Além da afinidade tag-seqüências ^5. passos de otimização Vários sobre o protocolo inicial de quitina induzida por transformação natural ⁶ são incorporados neste protocolo TransFLP. Estes incluem, entre outros, a substituição de fragmentos de conchas de caranguejos por disponível comercialmente quitina flocos ^8, a doação de PCR locais derivado de ADN como a transformação de material ^9, e a adição de sítios de recombinação FLP-alvo FRT () ^5. DRF permitir a excisão sítio-dirigida do marcador de selecção mediada pela recombinase Flp ^10.

Protocol

O método TransFLP (Figura 1) é exemplificado por três abordagens diferentes: I) a eliminação de dois genes adjacentes que codificam determinantes de virulência de V. cholerae (por exemplo, ΔctxAB), II) a remoção de uma ilha de patogenicidade (por exemplo, ΔVPI-1), e III) a integração de uma polimerase de RNA dependente de sequência do promotor de T7 a montante de um gene de interesse, o que permite a sua subsequentemente expressão artificial no fundo estirpe resp…

Representative Results

Os resultados representativos das três exemplos são mostrados nas Figuras 4 a 6. A primeira abordagem, que visa suprimir os genes vizinhos ctxA e CtxB. Juntos, eles codificar o principal fator de virulência de V. cholerae, a toxina da cólera. Concebemos oligonucleótidos para o método TransFLP como descrito acima e de acordo com a Figura 3. A estirpe parental, a estirpe portadora do intermediário FRT-flanqueado cassete de resistência a antibióticos no …

Discussion

O método TransFLP descrito acima e noutros locais ⁵ tem sido extensivamente utilizada no nosso laboratório. O tipo de manipulações genéticas que são viáveis ​​incluem, entre outros: a eliminação de genes individuais e aglomerados de genes, a deleção de ilhas genómicas (por exemplo, VPI-1), a inserção de sequências a montante de um gene de interesse (por exemplo, sequências do promotor) e da inserção sequências na extremidade de um gene específico (por exemplo,</em…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Chitin flakes	Sigma	C9213	Autoclaving required
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp)	Biorad	165-2100	Or comparable electroporators