1. Vävnadsberedning Harvest nya vävnader. För fågelembryon, öppna försiktigt ägg och rengör embryo i en skål med 1 x PBS, två gånger. För vuxna hjärnan, snabbt avlägsna hjärnan och försiktigt tvätta med 1 x PBS. Bädda in embryon eller vuxna hjärnan in i en inbäddad form full av oktober vävnad tek, orientera vävnaden som behövs för sektionering och snabbt frysa blocket genom att placera den i en etanol och torris blandningen, är noga med att inte få blandningen insidan av blocket . Skiva den frysta provet i en kryostat till 10-12 nm tjocka sektioner. För hjärna och embryonal vävnad, är den bästa skärande tempererade inom intervallet -18 ° C till -20 ° C. Montera frysta snitt om Super plus glasskivor. Förvara avsnitt i en bild box vid -80 ° C. 2. Generering av radioaktiva Riboprober (Använd förfaranden strålsäkerheten hos din institution) Skapa en renad linjär DNEn mall av en cDNA av intresse, antingen genom enzymet begränsad digerering av ett klonat fragment omgivet av RNA polymeras-promotor från en plasmid-DNA eller genom PCR av insatsen fäst till de RNA-bindande polymeraspromotor ställen. Det är också möjligt att generera PCR-fragment med de RNA-polymeraspromotorer såsom en del av 3 'och 5' PCR-primrar. Geler rena dina begränsade eller PCR-fragment med GENECLEAN gelrening kit. Att en 0,5 ml Eppendorf-rör, tillsätt 0,5-1 | ig renat linjär DNA-mall, transkription-buffert, DTT, RNasin, AGC nukleotidblandning lösning och RNas-fritt vatten för att bringa volymen upp till den önskade mängden. Tillsätt sedan S 35-UTP och lämplig RNA-polymeras för att göra antingen antisense-eller förnuft riboprober. Inkubera blandningen under 1 h i en 37 ° C vattenbad. Lägga till en annan alikvot av RNA-polymeras och inkubera under ytterligare 1 timme. Tillsätt 3M natriumacetatlösning (0,1-faldig total volym) och 100% EtOH (2,5 fold av totala volymen) i Eppendorf-rör för att fälla ut den syntetiserade RNA riboprob. Inkubera i torr is eller -80 ° C under 15 min eller mer än 3 timmar för att hjälpa utfällning. Pelleten RNA genom centrifugering vid 4 ° C och 15.000 varv per minut i en bordsskiva Eppendorf-centrifug i 30 min. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med 70% EtOH trycker med fingret för att blanda pelleten väl. Pelleten åter-RNA genom centrifugering vid 4 ° C och 15000 rpm under 30 minuter. Avlägsna supernatanten helt genom pipettering och sedan lägga 40 fil hybridiseringslösning. Blanda väl genom pipettering in och ut. Sätt 1 il av lösningen i 3 ml Safety-Lös lösning i scintillationskärl, blanda väl, och mäta de räknas i scintillationsräknare. Placera en Eppendorf med riboprob vid -20 ° C för användning inom en vecka. 3. Vävnad Behandling I en huva, bered nya PBS buffrad 4% paraformaldehyde lösningen till ca 3-5 ° C över rumstemperatur. Placera objektglasen från -80 ° C lagring i en metall kuggstång på torris, bära med arbetsutrymme under huven, och sedan placera stället i 4% paraformaldehyd-lösning och inkubera under 5 min vid rumstemperatur. Tvätta 3 gånger i 1 x PBS ca 15 doppningar vardera (omkring 1 sekund per doppning). I huven, gör acetylering buffert och skaka den kraftigt inom 10 sekunder. Omedelbart häll en bricka som innehåller rack av bilder och inkubera under 10 minuter, för att minska bakgrund bindning av riboprob. Skölj 3 gånger i 2 x SSPE under 15 doppningar. Torka i 70%, 95% och 100% EtOH seriell under 2 min i varje steg (behöver inte vara i huven). Torka objektglasen under huven i minst 10-15 min. 4. Hybridisering Beräkna mängden riboprob (0,5-1×10 6 cpm per bild) och hybridisering lösning (100 pl per bild) som behövs för alla bilder. Prewarm den riboprob-hybridiseringsblandning till 65 ° C under 5 min för att denaturera riboprob. Pipettera 100 pl riboprob-hybridisering lösning i en linje över bilden och använd ett täckglas för att sprida den jämnt över vävnaden och täckglaset. Placera objektglasen horisontellt riktad uppåt till en metall rack och plats rack långsamt upprätt i 65 ° C oljebad i minst 4 timmar och högst 16 timmar. Oljan skapar en lufttät tätning runt täckglasen. Ta bort metall hyllor från oljebadet och torka av överflödig olja runt rack med läskpapper. Tvätta olja från de berörda bilderna och metall rack i glas eller metall brickor som innehåller kloroform, två gånger. Den 2: a tvätt kloroform kan användas som den första för nästa experiment. Överför rack med täckta glider in en bricka med i 0,1% β-merkaptoetanol + 2 x SSPE lösning och rör sig upp och ner för några dips för att lossa täckglas och avlägsna lösa överskottet hybridisering lösningartion. Överför rack med täckta bilder i färsk lösning av 0,1% β-merkaptoetanol + 2 x SSPE, och ta sedan bort täckglas med en RNas gratis pincett i lösning för att undvika repor vävnadssnitt. Överföra de otäckta glider in frisk kuggstång i en bricka horisontell slid säteshållaren, i en lösning av 0,1% β-merkaptoetanol i 2 x SSPE. Inkubera kuggstången med bilder i färskt 0,1% β-merkaptoetanol + 2 x SSPE-lösning vid rumstemperatur under 1 h för att avlägsna överskott av obunden RNA-sond. Kassera denna och de tidigare vattenhaltiga tvättlösningarna, såväl som täckglas som radioaktivt avfall. Överföra kuggstången med objektglas till ett förvärmt 2x SSPE-lösning vid 65 ° C, tillsätt β-merkaptoetanol till en slutlig 0,1% koncentration, och inkubera vid 65 ° C under 1 timme. Kasta som radioaktivt avfall. Överföra och inkubera rack med bilder två gånger i förvärmt 0,1 x SPPE vid 65 ° C i 30 minuter vardera. Den mängd radioaktivitet avlägsnades idetta steg är mycket liten och inte längre betraktas som alltför radioaktivt avfall efter detta steg. Dehydratisera kuggstången och glider i 70%, 95% och 100% EtOH under 2 min vardera. Torka objektglasen i huven för minst 30 min. 5. Visualisering av radioaktivt Signal Placera torra bilder till en film kassett och i ett mörkt rum, placera x-ray film (Kodak BioMax MR-film) över bilderna och stäng kassetten. Kontrollera att de glider är vända emulsionen sidan av röntgenfilm. Exponera bilder under cirka 1-7 dagar beroende på förväntad förekomst av avskrifter. Utveckla x-ray film i vanlig utvecklare och fixare. Hybridiseringssignalen visas som svarta (exponerade silverkorn i emulsionen) på filmen (fig 1). (Valfritt) För att avgöra cellulär upplösning och se signal på vävnaden, bilderna måste doppas i fotografisk emulsion och motfärgades.Om du ska så småningom Motfärga med kresylviolett, sedan delipidize sektioner genom inkubering i xylen under 5 minuter vid rumstemperatur två gånger, rehydrera vardera 1 min i 100%, 100%, 95%, 95%, 70% och 50% EtOH och sedan i avjoniserat vatten. Om du inte kommer att färga med ett färgämne som inte kräver delipidization, då delipidization är inte nödvändigt. Torra bilder väl under en huva i minst 2-3 timmar. I det mörka rummet med ett säkert ljus, ösa ut tillräckligt Kodak NTB emulsion för att täcka halva bilden längden (dvs. vävnad) i glas doppa behållare och sedan smälta i en 42 ° C vattenbad under 20-30 min. Sedan späda ut den med destillerat vatten till ett förhållande av 1:1. Nivån av emulsionen ska nu omfatta alla delar i en bild när bilden doppas i den. Om du har en massa bilder, kan du behöva förbereda extra emulsion. Dip glider in i utspädda emulsionen i 42 ° C vattenbad och torra doppade glider i en sluten ljus tät behållare overnigHT i det mörka rummet, eller i en ugn vid 37 ° C under 2-3 timmar, med lamporna. Överför bilderna i rack spår i svarta lådor som innehåller exsickatorer, var försiktig för bilderna inte berör varandra och därmed skapa artefakter. Täta kanterna på lådorna med svart eltejp långsamt för att förhindra statisk-inducerade ljus gnistor och sedan svepa rutorna i aluminiumfolie. Lagra rutorna vid 4 ° C från flera dagar till veckor (signal från 1 dag på röntgenfilm liknar 5 dagar under emulsion). Värma de glider rutorna till rumstemperatur under 1 timme. I mörkrummet bort rack med bilder (eller den plats bilder i en metall rack om du använder lådor med bildspel slots) från lådorna och utveckla dem i Kodak D-19 utvecklaren på 16 ° C under 3,5 minuter. Tvätta de utvecklade objektglasen i kranvatten vid rumstemperatur under 1 min. Inkubera objektglasen två gånger i fixer vid 19 ° C under 6 min vardera. Belysning kan slås på under det andra fixer inkubation. </li> Tvätta glasen i rinnande vatten i rumstemperatur i minst 30 minuter och skrapa emulsionen från baksidan av bilden, medan "våta" med ett rakblad för att undvika repor på glaset. Fläcka vävnad med 0,3% kresylviolett i kranvatten under 5 minuter. Tvätta extra kresylviolett lösning i färskt kranvatten för ~ 15 dips. Torka objektglasen för ~ 15 dips i varje alkohollösning: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% och 100% EtOH. Inkubera objektglasen i xylen under 5 min vid rumstemperatur två gånger. Täckglaset med Permount medium på bilden och torka den täckta bilden i huven över natten (> 16 timmar), det kommer att ta flera dagar innan limmet är robust nog att rengöra bilderna ytterligare. 6. Generera Darkfield färgbilder Om det behövs ytterligare rena överskottet emulsion på baksidan av bilderna (icke-coversliped sida utan vävnad) genom att blöta den med vatten och skrapa med ett rakblad. <li> Skölj objektglasen med 80% EtOH-lösning och torka 1-2 gånger försiktigt för att bli av med skräp och damm. Ta bilder under mörkfält eller brightfield belysning. Steg 6.2 och 6,3 kan behöva upprepas 2-3 gånger för att erhålla en bra bilder utan dammpartiklar, som lätt ses i mörkfält under ett dissektionsmikroskop. 7. Representativa resultat Det finns två huvudsakliga sätt att se på in situ hybridisering resultat på vävnadssnitt hybridiserade med S 35 radioaktiva sönder: 1) x-ray film som placerades över bilderna eller 2) emulsion som belagts på bilderna. Ett tredje sätt är att använda en Phosphorlmager skärm som placeras över bilderna, men vi har inte varit nöjda med att lösa detta tillvägagångssätt. X-ray filmer ger ett snabbt resultat och analyser av det allmänna tillståndet för hybridisering. X-ray film data avslöjar också en bred anatomiska upplösning och kan användas för kvantitativa analysär 10. Exempel på röntgenfilm bilder av sena fågelembryo huvuden hybridiserade med antisens-prober för FoxP1 och CoupTF2 genexpression är i figurerna 1A och B. Båda generna förekommer rikligt i specifika delar av hjärnan underavdelningar. En god kvalitet röntgenfilm Resultatet bör bli högre (inte suddig) och har högt signal-till-bakgrund-förhållande. En suddig bild kan bero på ojämn kontakt mellan en röntgenfilm och glasskiva med den hybridiserade vävnaden. För emulsionsfärger doppade glider innehåller emulsionen ljuskänsliga silversalter belagda på den vävnad som apposed att vara på plast av röntgenfilm. Vid framkallningen, S 35, som är utsatta silversalter omvandlas till metalliskt silver korn, ungefär som i röntgenfilm. Men silver insättningar är direkt synliga över de celler som representerar genuttryck som kan observeras och mätas kvalitativt under ett mikroskop. De metalliska silverkorn blockerar direkt ljus genomoch visas som svarta prickar under brightfield vy. Den kresylviolett motfärg visas i violett (fig. 3A, 3C och fig 4). I mörkfält de silverkorn reflektera ljus som kommer från sidan och visas som vita prickar (Fig. 1C, 1D, 3B och 3D). I denna situation verkar kresylviolett färgas röd färg. I ljusfält, är hybridiseringssignalen lättare att se under hög förstoring vid cellulär upplösning, medan den i mörkfält, dessutom kan hybridiseringssignalen betraktas under lägre förstoring över hela vävnaden. Den mörkfält Utsikten är den strategi som vi vanligtvis använder för att visa övergripande mönstret genuttryck. Men i förhållande till den snabba resultatet från X-ray filmer, tar emulsionen doppade bilderna längre tid (en till flera veckor) och är mer känslig för att få bakgrunden. Det finns fyra vanliga källor till stark bakgrund: 1) Bakgrund hela x-ray film brukar göra för attproblem med utvecklare eller fixare, eller delvis exponerade filmen, 2) Bakgrund till objektglas är oftast på grund av problem med tvätt eller glas preparatet, såsom felaktig silination av bilderna från kommersiell källa eller egen förberedd, 3) emulsion exponering och utveckling bakgrund, och 4) Bakgrund avsnittet antingen på grund av brist på noggranna efter hybridisering tvättsteg, alltför låg hybridiseringstemperatur, dålig kvalitet på hybridiseringslösningen, paraformaldehyd föroreningar i diska orsaka sonder för att varaktigt över-link till vävnaden, riboprob nedbrytning vilket leder till små molekyler märkning vävnad ospecifikt, inaktiva DTT eller β-merkaptoetanol resulterar i tvärbindning av S 35-RNA-prober i di-sulfid obligationer till vävnaden, och väntar för länge för acetylering. Det är viktigt att ha bilderna i acetylering lösning inom några sekunder efter blandning av ättiksyraanhydrid och trietanolamin. Om några minuter passerar without lägga lösningen på bilderna, då acetylgrupper inte kommer att effektivt bort och sedan binda till RNA-ospecifikt. Andra faktorer inkluderar hybridisering över 20 h, vilket kan generera för stark av en signal, och överskott droppar olja på bilderna, som isolerar hybridiseringslösningen på bilderna under vattenbaserade tvättar, vilket resulterar i radioaktiva fläckar på vävnaden och glider ge mörk bakgrund signaler. Om man arbetar med många bilder (mer än 100 skivor), lägg till en 3: e kloroform tvätta eller ändra kloroform tvättar att förhindra alltför stora oljepartiklar från kvar på bilderna. Careless vävnad behandling, dvs inte frysa tillräckligt snabbt (inom 5-10 minuter efter dissektion) eller upptining och återfrysning ökar också bakgrunden på grund av mRNA nedbrytning. Var noga med att inte förväxla bakgrund till över exponeringen. För emulsion bakgrund på doppade bilderna är möjlig eftersom den är mycket ljuskänslig och kräver lång exponering i mörker. Com mon bakgrund problem är alltför hög temperatur för utvecklare och fixare. När temperaturen är högre än 19 ° C, nära eller varmare än rumstemperatur, är mer silver korn bakgrund erhölls. Exponering för låga nivåer av ljus läcker in ett mörkrum kommer att orsaka emulsion bakgrund. Inte uttvättning fixer tillräckligt lång (åtminstone 30 minuter i rinnande vatten), kommer att lämna fixer som sedan reagerar med kresylviolett för att generera en brunaktig fällning hela emulsionen. Men om bilderna tvättas i vatten längre än 90 minuter efter fixering före kresylviolett färgning, kan detta leda till att emulsionen blir lösa och sektionerna för att färga dåligt. Om det inte finns tillräckligt med tid för att färga objektglasen i en 30-90 minuter fönster efter fixering och tvättning efter 30 min tvättning, torkning av objektglasen under natten och vidare med kresylviolett färgning nästa dag. Generellt har de flesta mRNA har specifika genexpressionsmönster, medan bakgrundssignal är mer enhetlig. e_content "> vikta servetten kan vara vilseledande för resultat genuttryck på x-ray film, vilket leder till en region med mörkare signal. Ta reda på om vävnaden viks undersöka icke-färgade snitt i mörkfält eller kresylviolett färgade sektioner i brightfield. Cresyl violetta motfärgning ger ett bättre sätt att undersöka vävnaden skick. För en bättre tolkning av sond specificitet bör kontroll sensprober appliceras på flera intilliggande sektioner. De flesta sensprober visar inte en signal, men vissa gör, och när de gör det, finner vi att det ofta är annorlunda än antisense signalen. Vi tror att detta kan vara relaterat till antisens-syntes eller en annan gen på antisense-strängen av genomet. Vi presenterar ett exempel Pax6 känsla och antisensprober (Fig. 2A och B). Antisense-strängen avslöjar märkning längs den ventrikulära zonen av framhjärnan, cerebellum och ögat som förväntat (Fig. 2A), men den meningen avslöjar labeling i pigmentskiktet av näthinnan (fig. 2B). För sond storlekar, använder vi cDNA-prober som helst i intervallet 300-5000 bp. Sonder mindre än 300 bps arbete, men signalerna är oftast svagare. Vi har inte provat sonder större än 5000 bps. Det är bäst att använda prober för vävnad från samma art om möjligt. Om inte vi korshybridisera sonder på delar av andra arter och minska hybridisering och tvätta temperaturer i 3-5 ° C steg baserade på sekvensidentiteten, om känd. Om inte känt, då vi utför trial and error hybridisering och tvätta temperaturer. Om temperaturen sänks för mycket kan cDNA prob korshybridisera med andra mRNA av liknande sekvenser över arter eller i samma art 11. I praktiken finner vi att cDNA som är ~ 95% identisk eller större till mRNA-mål i vävnaden, den begränsande hybridiserings-och tvättemperatur (65 ° C) betingelser fungerar bra. För sekvenser som är i ringdees av ~ 85 till 94% identiska, hybridisering och tvätt temperaturen kan behöva minskas i intervallet ca 50 till 60 ° C. Skälet till att använda en metall kuggstång i de flesta stegen är användningen av kloroform tvättar och xylen. Båda organiska smälta många typer av plast. Glas och vissa typer av plaster är resistenta mot dessa organiska ämnen. Men glas är lättare att bryta, och vissa plaster som vid första är resistenta kommer att smälta för längre perioder av exponering för organiska ämnen. Figur 1. Autoradiografi av in-situ hybridisering bilder från x-ray filmer och emulsion doppade diabilder. (AB) röntgenfilm bilder av sagittala hela huvudet sektioner av zebra fink sångfågel vid embryonal dag 10, hybridiserades med antisens riboprober till (A) FoxP1 eller (B) CoupTF2, som tas med ljusfält belysning under ett dissektionsmikroskop. Svart, exponerade korn i filmen visar mRNA expressjon. Skalstreck = 500 ^ m. (CD) Emulsionspolymerisation doppades diabilder i sagittala hela huvudet sektioner av zebra fink vid efter kläckning dag 6, hybridiserades med antisens riboprober till (C) FoxP1 och (D) CoupTF2, som tas med mörkfält belysning enligt ett dissektionsmikroskop. Vit, exponerade silverkorn i emulsion ovan vävnaden visar mRNA uttryck. Röd, kresyl violett fläck. Skalstreck = 200 nm. För alla bilder, är det näbb rostral till vänster. De röntgenfilm bilder exponerades under en dag, doppade objektglas under 3 dagar. Den FoxP1 proben är 178 bp till 1544-1711 bp del av mRNA: t; CoupTF2 är 545 bp till 1-545 bp del av mRNA. Såsom kan ses, i framhjärnan FoxP1 mRNA anrikat i mesopallium (M), striatum (ST) och dorsala talamus (DT), medan CoupTF2 anrikas i den nidopallium (N), arcopallium (A), och mer ventrala talamus . Det finns konsekvens i uttrycket mellan exponering typer (och åldrar). Med doppade bilderna dock en högre upplösning märkning sett, end vävnad gränserna och delområdena är direkt identifieras. Dessa och alla andra bilder som visas i tidningen är från sektioner med hjälp av standarden 65 ° C med hög stringens hybridisering. Figur 2. Jämförelse av antisense och känner märkning som visar olika mönster. (A) antisense-strängen av Pax6 uttrycktes i hjärnan, speciellt den ventrikulära zonen (vit pil). Som visas är autoradiografi på x-ray filmer av sagittal hela huvudet skivor tagna från zebra finch kl embryonala dag 12. (B) intill sektionen hybridiseras med sense-strängen av Pax6 avslöjar ingen bakgrund uttryck genom hela embryot huvudet, men uppenbart uttryck i pigmentskiktet av näthinnan (svarta pilar) som antisenssträngen. Den streckade linjen indikerar konturen av hela hjärnan. C: cerebellum. <st Rong> Figur 3. In situ signaler genuttryck i emulsion doppade bilder tagna från zebra finch hjärnan under sena embryonala stadier enligt brightfield och Darkfield åsikter. (A) Brightfield bild av D1B expression vid embryonal dag 10 från en normal exponering för emulsionen. Etiketten (svart) kan knappt ses på den här förstoring. Sonden är 625 bp till 1-625 bp del av mRNA. (B) Identiska sektion och förstoring som i (A) men kopplat till mörkfält visande etiketten (vit) i striatum (ST) och talamus (TH). (C) Brightfield bild av Slit3 expression vid embryonal dag 12 från en överexponering av emulsionen. Label (svart) kan enkelt ses. Sonden är 779 bp till 1243-2021 del av mRNA. (B) Identisk avsnitt och förstoring som i (A) över till mörkfält visar etiketten (vit) i ryggmärgen (SC) som matchar brightfield bilden. Rostralt är orienterad till vänster. CB: cerebellum. / 3764/3764fig4.jpg "alt =" Bild 4 "/> Figur 4. Silver korn upplösning på cellnivå. Som visas är FoxP1 mRNA etikett i zebra finch framhjärnan med silverkorn (svarta prickar) över celler (kresylviolett) i olika hjärnregioner och åldrar jämfört med lägre effekt bilder av figur 1A och 1C. (A) rikligt uttryck över enskilda celler (svarta pilar) i den vuxna zebra finch mesopallium. (B) Låg förekomst uttryck över enskilda celler (svarta pilspetsar) i det angränsande nidopallium av samma sektion. (C) Hög FoxP1 mRNA-uttryck över celler (svarta pilar) i embryonal dag 12 mesopallium. (D) Låg förekomst uttryck över celler (svarta pilar) i det angränsande nidopallium av samma sektion. Exempel celler inringade med en gul linje. Embryonala celler (C och D) är mindre och mer tätt packade jämfört med vuxna celler (A och B). Den eftersom det inte finns några mellanrum mellan cellerna och emulsion, varvid den yta av exponerat silver kornen från S 35 sonden är något större än arean av cellkropparna. Skalstreck = 10 pm.