에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em> 생체 내</em의> 이미징<em> C. elegans</em><em> Drosophila</em>와 Zebrafish
Summary
간단한 마이크로 유체 장치는 마취 무료를 수행하기 위해 개발되었습니다<em> 생체 내</em의> 이미징<em> C. elegans</em>, 그대로<em> Drosophila</em> 애벌레와 zebrafish의 애벌레. 이 장치는 심장 박동, 세포 분열 및 하위 세포 neuronal 교통 등 다양한 과정의 시간 경과 영상을 수행하기 위해이 모델 생물을 고정 할 수있는 변형 PDMS 막을 활용합니다. 우리는이 장치의 사용을 설명하고 다른 모델 시스템에서 수집 된 데이터의 다양한 유형의 예를 보여줍니다.
Abstract
마이크로 가공 유체 장치는 작은 생물의 생체 연구에 대한 접근 마이크로 환경을 제공합니다. 간단한 제조 공정은 소프트 리소그래피 기술 1-3을 사용하여 마이크로 유체 장치에서 사용할 수 있습니다. 마이크로 유체 장치는 생체 레이저 미세 2,6 및 셀룰러 이미징 4,7에서 하위 세포 이미징 4,5에 사용되었습니다. 생체에서 영상이 생물의 고정이 필요합니다. 이것은 흡입 5,8을 사용하여 달성되었습니다 테이퍼 채널 6,7,9, 변형 멤브레인 2-4,10, 추가 냉각 5, 마취 가스 11, 온도에 민감한 젤 12, 시아 노 아세틸렌 접착제 13 등 levamisole 14 등 anesthetics와 흡입 15. 일반적으로 사용 anesthetics는 시냅스 전송 16,17 영향을 미치는와 하위 세포 neuronal 교통 4 해로운 영향을 미칠 것으로 알려져 있습니다. 이 성에서udy 우리는 Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila의 애벌레와 zebrafish의 애벌레로 그대로 유전 모델 생물의 마취 무료로 고정 할 수 있습니다 폴리 디메틸 실록산 – (PDMS) 장치 기반 멤브레인을 보여줍니다. 이 모델 생물로 인해 자신의 작은 직경과 광학적 투명 또는 반투명 기관의 마이크로 유체 장치에서 생체의 연구에 적합합니다. 바디 직경은 C.의 조기 애벌레의 단계에 대해 ~ 10 μm ~ 800 μm의에 다양 elegans와 zebrafish 애벌레와 고해상도 시간 경과 영상에 대한 완전한 고정을 달성하기 위해 서로 다른 크기의 마이크로 유체 장치가 필요합니다. 이 생명체는 액체 열을 통해 압축 된 질소 가스에 의해 적용 역 현미경을 사용하여 이미지로 압력을 사용하여 고정합니다. 함정에서 출시 된 동물은 10 분 이내에 정상 운동으로 돌아갑니다.
우리는 C.에 시간 경과 영상의 네 개의 응용 프로그램을 보여줍니다 elegans즉, 뉴런의 이미지 mitochondrial 교통, 교통 – 결함이있는 돌연변이, glutamate 수용체 운송 및 Q의 neuroblast의 세포 분열에 미리 신경 소포 전송. 같은 영화에서 얻은 데이터는 마이크로 유체 고정이 anesthetized 동물 (그림 1J와 3C-F 4)에 비해 휴대 및 하위 세포 사건의 생체 데이터를 수집하는 유용하고 정확한 방법입니다 보여줍니다.
장치 크기가 C. 서로 다른 단계의 시간 경과 영상을 허용하도록 변경되었습니다 elegans 먼저 instar Drosophila의 애벌레와 zebrafish의 애벌레. 감각 뉴런에 GFP (syt.eGFP)로 태그를 synaptotagmin로 표시 소포의 운송은 그대로 첫번째 instar Drosophila의 애벌레의 cholinergic 감각 뉴런으로 표현 시냅스 소포 마커의 이동 움직임을 보여줍니다. 유사한 장치 ~ 30 시간 게시물 수정을 (hpf)에 심장 박동의 시간 경과 영상을 수행하는 데 사용되었습니다애벌레를 zebrafish. 이러한 데이터는 우리가 개발 한 간단한 장치가 생체에 여러 세포 생물학 및 발달 현상을 연구하는 모델 시스템의 다양한에 적용 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS 마이크로 유체 장치는 따라서 모든 반투명 / 투명 모델 생물의 생체 이미징의 높은 해상도에 사용할 수 있습니다 광학적으로 투명합니다. 우리 디자인은 그대로 살아있는 동물의 세포와 하위 세포 사건의 높은 배율 spatio – 시간적 이미지에 적합합니다. 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 Microfabrication 모델 생물의 다양한 크기 장치 크기를 쉽게 조작 할 수 있습니다. 다양한 크기의 디?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 C.에 nuIs25과 CGC를 들어, Drosophila 새장을 유지하기위한 Drosophila 주식, Tarjani Agarwal에 피터 Juo을 박사 Krishanu 레이 감사 elegans 긴장. SPK는 마이클 구 중창단의 연구실에서 jsIs609했다. 우리는 마이크로 유체 장치에서 jsIs609 동물의 미토콘드리아 교통 시간 경과 영상에서 자신의 도움을 Arpan Agnihotri (BITS Pilani)을 감사드립니다. 우리는 zebrafish 배아으로 우리를 제공하는 박사 Vatsala Thirumalai 및 Surya Prakash에 감사하고 있습니다. 우리는 나노 기술 (제 SR/55/NM-36-2005)의 과학 기술 – 센터의 부서에 의해 지원 회전 디스크 공 촛점 현미경의 사용에 대한 NCBS에서 박사 크리슈나와 CIFF 감사드립니다. 우리는 또한 토론을 Kaustubh Rau, V. Venkatraman과 Chetana Sachidanand 감사드립니다. 이 작품은 DBT 후 박사 휄로 십 (SM), DST 빠른 속도로 트랙 체계 (SM)와에 DBT 부여 (SPK)에 의해 재정 지원되었다. SA는 SPK에 DST와 CSIR 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
| Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
| Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
| HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
| SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
| Developer | Microchem | SU8 Developer | |
| Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
| UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
| Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
| Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
| Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
| Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
| Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
| Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
| Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
| 3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
| Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
| Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |
References
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