Enkla mikroflödessystem enheter för<em> In vivo</em> Avbildning av<em> C. elegans</em>,<em> Drosophila</em> Och zebrafisk
Summary
En enkel mikrofluidikanordning har utvecklats för att utföra bedövningsmedel gratis<em> In vivo</em> Avbildning av<em> C. elegans</em>, Intakt<em> Drosophila</em> Larver och zebrafisk larver. Enheten använder en deformerbar PDMS membran för att immobilisera dessa modellorganismer för att utföra avbildning tidsförlopp av flera processer som hjärtslag, celldelning och sub-cellulära neuronal transporter. Vi visar användningen av denna enhet och visa exempel på olika typer av data som samlats in från olika modellsystem.
Abstract
Micro tillverkade fluidic enheter ger en tillgänglig mikro-miljö för in vivo-studier på små organismer. Enkla tillverkningsprocesser finns för mikroflödessystem enheter som använder mjuk litografi tekniker 1-3. Mikrofluidanordningar har använts för sub-cellulär avbildning 4,5, in vivo-laser mikrokirurgi 2,6 och cellulär avbildning 4,7. Avbildning in vivo kräver immobilisering av organismer. Detta har uppnåtts med hjälp sug 5,8, avsmalnande kanaler 6,7,9, deformerbara membran 2-4,10, sug med extra kylning 5, anestesigas 11, temperaturkänsliga geler 12, cyanoakrylatlim 13 och anestetika såsom levamisol 14 , 15. Vanligt använda bedövningsmedel påverkar synaptisk transmission 16,17 och är kända för att ha skadliga effekter på sub-cellulära neuronal transporter 4. I denna mUdy visar vi ett membran baserad poly-dimetyl-siloxan (PDMS) enhet som tillåter bedövningsmedel fri immobilisering av intakta genetiska modellorganismer som Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larver och zebrafisk larver. Dessa modellorganismer är lämpliga för in vivo-studier på mikrofluidikanordningar på grund av deras små diametrar och optiskt transparenta eller genomskinliga organ. Body diametrar varierar från ~ 10 | im till ~ 800 | im för tidiga larvstadier av C. elegans och zebrafisk larver och kräver mikrofluidikanordningar i olika storlekar för att uppnå fullständig immobilisering för hög upplösning time-lapse avbildning. Dessa organismer är immobiliserade med tryck appliceras av komprimerad kvävgas genom en vätskepelare och avbildades med användning av ett inverterat mikroskop. Djur som frigörs från fällan återgå till normal förflyttning inom 10 minuter.
Vi visar fyra tillämpningar av time-lapse avbildning i C. elegansnämligen bildbehandling mitokondriell transport i nervceller, presynaptisk vesikel transport i en transport-defekt mutant, glutamatreceptor transport och Q neuroblast celldelning. Data från sådana filmer visar att mikroflödessystem immobilisering är ett användbart och korrekt sätt att förvärva in vivo-data av cellulära och sub-cellulära händelser jämfört med sövda djur (Figur 1J och 3C-F 4).
Device dimensioner förändrades så att time-lapse avbildning av olika stadier av C. elegans, första stadiet Drosophila larver och zebrafisk larver. Transport av vesiklar markerade med synaptotagmin taggade med GFP (syt.eGFP) i sensoriska neuroner visar riktat rörelse av synaptiska vesikler markörer uttrycks i kolinerga sensoriska neuroner i intakt första stadiet Drosophila larver. En liknande anordning har använts för att utföra tidsförlopp avbildning av hjärtslag i ~ 30 timmar efter befruktning (HPF)zebrafisk larver. Dessa data visar att de enkla anordningar som vi har utvecklat kan appliceras på en mängd olika modellsystem för att studera flera cellbiologiska och utvecklingsmässiga fenomen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS mikroflödessystem enheter är optiskt transparent kan därför användas för högupplöst in vivo avbildning av en transparent / genomskinlig modell organism. Vår design är lämplig för hög förstoring tid och rum avbildning av cellulära och sub-cellulära händelser i intakta levande djur. Mikrofabrikation med mjuk litografi teknik möjliggör enkel hantering av enheten dimensioner för olika storlekar av modellorganismer. Enheter av olika storlekar tillverkas för olika stadier av C. elegans, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Krishanu Ray för Drosophila aktier, Tarjani Agarwal för att upprätthålla en Drosophila bur, Peter Juo för nuIs25 och CGC för C. elegans stammar. SPK gjorde jsIs609 i Michael Nonet laboratorium. Vi tackar Arpan Agnihotri (BITS Pilani) för hans hjälp i tid-lapse avbildning av mitokondrier transport av jsIs609 djur i mikroflödessystem enheter. Vi är tacksamma till Dr Vatsala Thirumalai och Surya Prakash för att förse oss med zebrafisk embryon. Vi tackar Dr Krishna och CIFF vid nationella centralbankerna för användning av roterande skiva konfokalmikroskop stöds av Institutionen för teknik och naturvetenskap, Centrum för nanoteknik (nr SR/55/NM-36-2005). Vi tackar också Kaustubh Rau, V. Venkatraman och Chetana Sachidanand för diskussioner. Detta arbete har finansierats av DBT postdoktorala stipendium (SM), DST snabba system (SM) och en DBT bidrag till (SPK). SA stöddes av DST och CSIR bidrag till SPK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
| Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
| Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
| HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
| SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
| Developer | Microchem | SU8 Developer | |
| Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
| UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
| Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
| Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
| Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
| Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
| Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
| Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
| Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
| 3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
| Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
| Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |
References
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
- Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Génétique. 95, 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
- Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
- Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
- Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
- Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
- Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
- Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
- Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
- Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
