وصفت طريقة لالمكانية والزمانية السيطرة على نشاط GTPase صغيرة من الضوء. ويستند هذا الأسلوب على heterodimerization FKBP-FRB rapamycin التي يسببها ونظم الصور الحبس. تعظيم الاستفادة من أشعة الضوء تمكن من تفعيل المكانية والزمان التحكم من GTPases الصغيرة على مستوى التحت خلوية.
تنظيم دينامية الأسرة رو من triphosphatases فسفات الصغيرة (GTPases) مع الدقة المكانية كبير أمر ضروري للوظائف الخلوية المختلفة والمناسبات 1 و 2. وقد كشفت عن طبيعتها الديناميكية spatiotemporally التي تصور من نشاطهم والتوطين في 3 في الوقت الحقيقي. من اجل الحصول على فهم أعمق لدورهم في الوظائف الخلوية المختلفة على المستوى الجزيئي، ينبغي أن تكون الخطوة التالية اضطراب الأنشطة في مكان وجود بروتين التحت خلوية دقيقة وتوقيت.
لتحقيق هذا الهدف، قمنا بتطوير طريقة لصنع ضوء، المكانية والزمان تفعيل رقابة من GTPases الصغيرة من خلال الجمع بين اثنين من التقنيات: (1) rapamycin التي يسببها FKBP-FRB heterodimerization و (2) طريقة الصور والحبس من rapamycin. مع استخدام heterodimerization FKBP-FRB rapamycin بوساطة، وقد طورنا طريقة لقابل للتحريض بسرعة تفعيل أو تعطيل من includi GTPases صغيرنانوغرام RAC 4، Cdc42 4، 4 ورأس RhoA 5، الذي يدفع rapamycin إزفاء من FKBP-تنصهر GTPases، أو تفعيل لها، إلى غشاء البلازما حيث يرتكز FRB. لاقتران مع هذا النظام heterodimerization، وضعنا أيضا نظام الصور والحبس من rapamycin النظير. مجمع الصور في قفص هو جزيء صغير النشاط الذي يتم قمع مع مجموعة photocleavable حماية المعروفة باسم مجموعة الحبس. لقمع نشاط heterodimerization تماما، قمنا بتصميم rapamycin قفص التي يتم مربوط الى جزيء مثل هذا المجمع الناتج كبير لا يستطيعون عبور غشاء البلازما، مما يؤدي إلى نشاط عمليا خلفية لا بوصفها dimerizer الكيميائية داخل الخلايا 6. ويوضح الشكل 1 مخطط لدينا نظام. مع مزيج من هذين النظامين، ونحن المعينين محليا منشط طلب إلى غشاء البلازما في فترة زمنية من ثانية، وحقق الضوء الناجم عن تفعيل طلب في ليف التحت خلويةش 6.
ووصف لدينا التقنية التي توظف رواية قفص مركب جنبا إلى جنب مع نظام heterodimerization FKBP-FRB من أجل التعامل مع رو GTPase النشاط في مكان وجود التحت خلوية دقيق على نطاق ومرة ثانية.
هناك ثلاثة أوجه القصور في النهج الحالي. أولا، لأنه يعتمد الأسلوب…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة تمويل بحوث (DK090868 وGM092930 إلى TI). هناك براءة اختراع معلقة على التناظرية rapamycin في قفص.
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
Rapamycin | Tecoland | RAPA99 |
FuGENE HD | Roche | 04709691001 |
Avidin | Sigma | A9275-10MG |
DMSO | Sigma | D2650-5X5ML |
Size-exclusion column | GE Healthcare | Spin Trap G-25 |
Glass bottom 8-well chamber | Thermo Scientific | 12-565-47 |
Inverted Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert200M |
UV LED light source | Rapp Opto Electronics | UVILED |
Confocal spinning disk | Yokogawa Electric Corp. | CSU10 |
CCD camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-ER |
100x Objective lens | Zeiss | Plan Apochromat |
Synthetic scheme of cRb (Copyright ACS2011) 6
Synthetic conditions: (a) BnBr, K2CO3, DMF (b) f.HNO3, AcOH (c) TFA (d) Propargyl-Br, K2CO3, DMF, (e) glycerol, cat. pTsA, Toluene (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf2O, Pyridin (h) methanol HCl, (i) LiAlH4, THF (j) TsCl, Pyridine, CH2Cl2 (k) NaN3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH2Cl2 (m) 13, CuSO4, Ascorbate, 2-propanol, H2O, CH2Cl2.