리빙 셀의 Subcellular 수준과 초 Timescale에 작은 GTPase 활동의 Spatio-시간적 조작
Summary
빛으로 작은 GTPase 활동 spatio-시간적 제어를위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 rapamycin-유도 FKBP-FRB의 heterodimerization 및 사진 caging 시스템을 기반으로합니다. 빛을 조사의 최적화는 subcellular 수준에서 작은 GTPases의 spatio-temporally 제어 활성화를 가능하게합니다.
Abstract
위대한 spatiotemporal 정밀도와 작은 구아 노신의 triphosphatases (GTPases)의 Rho 가족의 동적 규제는 다양한 세포 기능과 이벤트가 1, 2 필수적입니다. 그들의 spatiotemporally 동적 특성은 실시간 3 그들의 활동 및 현지화의 시각화에 의해 발표되었습니다. 분자 수준에서 다양한 세포 기능에서의 역할 깊은 이해를 얻을하려면, 다음 단계는 정확한 subcellular 위치와 타이밍에 단백질 활동의 섭동 있어야합니다.
(1) rapamycin-유도 FKBP-FRB의 heterodimerization와 rapamycin (2) 사진 caging 방법 : 이러한 목표를 달성하기 위해, 우리는 빛을 유발, 두 기술을 결합하여 작은 GTPases의 spatio-temporally 제어 활성화를위한 방법을 개발했습니다. rapamycin-매개 FKBP-FRB의 heterodimerization의 사용으로, 우리는 급속하게 작은 GTPases includi의 활성화 또는 불활 성화를 inducible하는 방법을 개발했습니다NG RAC 4, rapamycin은 FRB가 정박되어 플라즈마 막까지, FKBP-융합된 GTPases, 또는 그들의 activators의 translocation을 유도하는 Cdc42 4, RhoA 4 RAS 5. 이 heterodimerization 시스템과 커플링 들어, 우리는 또한 rapamycin의 analogs의 사진 caging 시스템을 개발했습니다. 사진 갇힌 화합물은 누구 활동 caging 그룹으로 알려진 photocleavable 보호 그룹과 억압되어 작은 분자이다. 완전히 heterodimerization 활동을 억제하기 위해, 우리는 세포 6 안의 화학 dimerizer로 거의없이 백그라운드 작업으로 이어지는, 그 결과 대규모 복합 단지 플라즈마 막 건너없는 그런 macromolecule에 닿는 곳에있다 갇힌 rapamycin을 설계했습니다. 그림 1은 우리의 방식을 보여줍니다 시스템. 이 두 시스템의 결합을 통해, 우리는 로컬 초 timescale에 플라즈마 막에 RAC 활성을 모집하고 subcellular 레바에 빛을 유발 RAC 인증을 획득엘 6.
Protocol
Discussion
우리는 초 시간 척도에 대한 정밀한 subcellular 위치에 Rho GTPase 활동을 조작하기 위해 FKBP-FRB heterodimerization 시스템 소설 갇힌 화합물을 함께 고용 기법을 설명했다.
현재의 접근 방법의 세 한계가 있습니다. 메서드가 플라즈마 막 걸쳐 dimerizer의 확산을 방지하거나 허용을 기반으로하고 있기 때문에 첫째, 대상 세포 위치는 플라즈마 막 또는 그 주변 있어야합니다. cRb의 화학 구?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 연구 기금 (DK090868과 TI의 GM092930)에 의해 지원되었다. 갇힌 rapamycin 유사체에 대한 출원 특허가있다.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
| Rapamycin | Tecoland | RAPA99 |
| FuGENE HD | Roche | 04709691001 |
| Avidin | Sigma | A9275-10MG |
| DMSO | Sigma | D2650-5X5ML |
| Size-exclusion column | GE Healthcare | Spin Trap G-25 |
| Glass bottom 8-well chamber | Thermo Scientific | 12-565-47 |
| Inverted Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert200M |
| UV LED light source | Rapp Opto Electronics | UVILED |
| Confocal spinning disk | Yokogawa Electric Corp. | CSU10 |
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-ER |
| 100x Objective lens | Zeiss | Plan Apochromat |
Synthetic scheme of cRb (Copyright ACS2011) 6
Synthetic conditions: (a) BnBr, K2CO3, DMF (b) f.HNO3, AcOH (c) TFA (d) Propargyl-Br, K2CO3, DMF, (e) glycerol, cat. pTsA, Toluene (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf2O, Pyridin (h) methanol HCl, (i) LiAlH4, THF (j) TsCl, Pyridine, CH2Cl2 (k) NaN3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH2Cl2 (m) 13, CuSO4, Ascorbate, 2-propanol, H2O, CH2Cl2.
References
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
- Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
- Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
- Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
- Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
- Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
- Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
- Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).
