Subcellular स्तर पर और सेकंड के timescale पर spatio-अस्थायी लघु GTPase गतिविधि के जीवित कोशिकाओं में हेरफेर
Summary
Spatio-अस्थायी प्रकाश द्वारा छोटे GTPase गतिविधि के नियंत्रण के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है. इस विधि rapamycin प्रेरित heterodimerization FKBP FRB और तस्वीर caging प्रणाली पर आधारित है. प्रकाश विकिरण के अनुकूलन स्तर subcellular पर छोटे GTPases spatio-अस्थायी नियंत्रित सक्रियण सक्षम बनाता है.
Abstract
महान spatiotemporal परिशुद्धता के साथ छोटे ग्वानोसिन triphosphatases के (GTPases) रो परिवार के गतिशील विनियमन विभिन्न सेलुलर कार्यों और घटनाओं 1, 2 के लिए आवश्यक है. उनके में गतिशील spatiotemporally प्रकृति उनकी गतिविधि और वास्तविक समय 3 में स्थानीयकरण का दृश्य द्वारा प्रगट किया गया है. आदेश में आण्विक स्तर पर विविध सेलुलर कार्यों में उनकी भूमिका की गहरी समझ हासिल करने के लिए, अगले कदम प्रोटीन गतिविधियों की गड़बड़ी एक सटीक subcellular स्थान और समय पर होना चाहिए.
(1) rapamycin प्रेरित heterodimerization FKBP FRB और (2) rapamycin के एक तस्वीर caging विधि: इस लक्ष्य को प्राप्त करने, हम प्रकाश प्रेरित, स्थानिक, अस्थायी दो तकनीकों के संयोजन से छोटे GTPases नियंत्रित सक्रियण के लिए एक विधि विकसित की है. Rapamycin की मध्यस्थता heterodimerization FKBP-FRB का उपयोग के साथ, हम तेजी से या छोटे GTPases includi के सक्रियण निष्क्रियता inducible के लिए एक विधि विकसित की हैएनजी 4 आरएसी, Cdc42, 4 4 RhoA और 5 रास, जिसमें rapamycin FKBP इनकार GTPases, या उनके activators का स्थानान्तरण लाती है जहां FRB लंगर प्लाज्मा झिल्ली,. इस heterodimerization प्रणाली के साथ युग्मन के लिए, हम भी rapamycin एनालॉग के एक तस्वीर caging प्रणाली विकसित किया है. एक मिश्रित तस्वीर कैद एक छोटा सा अणु जिसका गतिविधि है एक photocleavable रक्षा caging समूह के रूप में जाना जाता समूह के साथ दबा है. पूरी तरह से heterodimerization गतिविधि को दबाने के लिए, हम है कि एक ऐसी है कि जिसके परिणामस्वरूप बड़े जटिल प्लाज्मा झिल्ली को पार नहीं कर सकते macromolecule के लिए सीमित है एक बंदी rapamycin डिजाइन, 6 कोशिकाओं के अंदर एक रासायनिक dimerizer के रूप में वस्तुतः कोई पृष्ठभूमि गतिविधि के लिए प्रमुख चित्रा 1 हमारी योजना को दिखाता है. प्रणाली. इन दोनों प्रणालियों के संयोजन के साथ, हम स्थानीय स्तर पर सेकंड के एक timescale पर प्लाज्मा झिल्ली के लिए एक आरएसी उत्प्रेरक और भर्ती subcellular लेव पर प्रकाश प्रेरित आरएसी सक्रियण हासिल की6 एल.
Protocol
Discussion
हम एक तकनीक है कि एक बंदी परिसर उपन्यास रोजगार FRB heterodimerization FKBP प्रणाली के साथ एक साथ क्रम में करने के लिए सेकंड के एक समय के पैमाने पर एक सटीक subcellular स्थान पर रो GTPase गतिविधि में हेरफेर का वर्णन किया.
वर?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन NIH अनुसंधान के वित्तपोषण (DK090868 और GM092930 तिवारी) द्वारा समर्थित किया गया. वहाँ एक बंदी rapamycin के अनुरूप पर एक पेटेंट लंबित है.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
| Rapamycin | Tecoland | RAPA99 |
| FuGENE HD | Roche | 04709691001 |
| Avidin | Sigma | A9275-10MG |
| DMSO | Sigma | D2650-5X5ML |
| Size-exclusion column | GE Healthcare | Spin Trap G-25 |
| Glass bottom 8-well chamber | Thermo Scientific | 12-565-47 |
| Inverted Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert200M |
| UV LED light source | Rapp Opto Electronics | UVILED |
| Confocal spinning disk | Yokogawa Electric Corp. | CSU10 |
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-ER |
| 100x Objective lens | Zeiss | Plan Apochromat |
Synthetic scheme of cRb (Copyright ACS2011) 6
Synthetic conditions: (a) BnBr, K2CO3, DMF (b) f.HNO3, AcOH (c) TFA (d) Propargyl-Br, K2CO3, DMF, (e) glycerol, cat. pTsA, Toluene (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf2O, Pyridin (h) methanol HCl, (i) LiAlH4, THF (j) TsCl, Pyridine, CH2Cl2 (k) NaN3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH2Cl2 (m) 13, CuSO4, Ascorbate, 2-propanol, H2O, CH2Cl2.
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