Tid och rum Manipulering av små GTPas aktivitet på Subcellulär nivå och Tidsplan sekunder i levande celler
Summary
En metod för spatio-temporal kontroll av små GTPas-aktivitet genom ljus beskrivs. Denna metod är baserad på rapamycin-inducerad FKBP-FRB heterodimerisering och foto-placering i kasse system. Optimering av ljus-bestrålning gör det möjligt för rums-tidsmässigt styrd aktivering av små GTPases på subcellulära nivå.
Abstract
Dynamisk reglering av Rho familj av små guanosin triphosphatases (GTPases) med stor Spatiotemporal precision är viktigt för olika cellfunktioner och evenemang 1, 2. Deras spatiotemporally dynamiska karaktär har avslöjats av visualisering av deras verksamhet och lokalisering i realtid 3. För att få djupare förståelse för deras roller i olika cellulära funktioner på molekylär nivå, bör nästa steg vara störning av protein aktiviteter på ett exakt subcellulär plats och tidpunkt.
För att uppnå detta mål har vi utvecklat en metod för ljus-inducerad, rums-tidsmässigt styrd aktivering av små GTPases genom att kombinera två metoder: (1) rapamycin-inducerad FKBP-FRB heterodimerisering och (2) en foto-placering i bur metod rapamycin. Med hjälp av rapamycin-medierad FKBP-FRB heterodimerisering, har vi utvecklat en metod för att snabbt induceras aktivering eller inaktivering av små GTPases including Rac 4, 4 Cdc42, RhoA 4 och Ras 5, i vilken rapamycin inducerar translokation av FKBP-fuserade GTPaser, eller deras aktivatorer, till plasmamembranet där FRB är förankrad. För koppling med detta heterodimerisering system har vi också utvecklat en foto-placering i bur system rapamycin analoger. Ett foto-bur föreningen är en liten molekyl vars aktivitet hämmas med en fotoklyvbar grupp känd som en bur grupp. För att undertrycka heterodimerisering verksamheten helt, utformade vi en bur rapamycin som är bundna till en makromolekyl så att det resulterande stora komplexet inte kan passera plasmamembranet, vilket leder till praktiskt taget ingen bakgrund aktivitet som en kemisk Dimeriserings inuti celler 6. Figur 1 visar ett schema av vår systemet. Med kombinationen av dessa båda system, rekryterade vi lokalt ett Rac aktivator till plasmamembranet på en tidsskala av sekunder och nådde ljus-inducerad Rac aktivering på subcellulära Level 6.
Protocol
Discussion
Vi beskrivit en teknik som använder en ny bur förening tillsammans med FKBP-FRB heterodimerisering system för att manipulera Rho GTPase verksamhet på ett exakt subcellulär plats på en tidsskala av sekunder.
Det finns tre begränsningar av det nuvarande tillvägagångssättet. För det första eftersom metoden bygger på att förebygga eller tillåter diffusion av Dimeriserings över plasmamembranet behöver målet cellulära platsen att vara plasmamembranet eller dess närhet. Ytterlig…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av NIH forskningsmedel (DK090868 och GM092930 till TI). Det finns en väntande patent på en bur rapamycin analog.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
| Rapamycin | Tecoland | RAPA99 |
| FuGENE HD | Roche | 04709691001 |
| Avidin | Sigma | A9275-10MG |
| DMSO | Sigma | D2650-5X5ML |
| Size-exclusion column | GE Healthcare | Spin Trap G-25 |
| Glass bottom 8-well chamber | Thermo Scientific | 12-565-47 |
| Inverted Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert200M |
| UV LED light source | Rapp Opto Electronics | UVILED |
| Confocal spinning disk | Yokogawa Electric Corp. | CSU10 |
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-ER |
| 100x Objective lens | Zeiss | Plan Apochromat |
Synthetic scheme of cRb (Copyright ACS2011) 6
Synthetic conditions: (a) BnBr, K2CO3, DMF (b) f.HNO3, AcOH (c) TFA (d) Propargyl-Br, K2CO3, DMF, (e) glycerol, cat. pTsA, Toluene (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf2O, Pyridin (h) methanol HCl, (i) LiAlH4, THF (j) TsCl, Pyridine, CH2Cl2 (k) NaN3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH2Cl2 (m) 13, CuSO4, Ascorbate, 2-propanol, H2O, CH2Cl2.
References
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
- Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
- Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
- Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
- Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
- Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
- Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
- Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).
