युगपत वोल्टेज दबाना और Amperometry साथ dopamine जारी की एकल कोशिका मापन
Summary
amperometric तकनीक oxidative सहज dopamine oxidization द्वारा उत्पादित वर्तमान पता लगाने के द्वारा एक एकल कोशिका से dopamine रिलीज उपाय. युगपत वोल्टेज क्लैंप और amperometry पद्धति dopamine ट्रांसपोर्टर और dopamine के रिवर्स परिवहन पर इस गतिविधि के नियामक भूमिका के समग्र "गतिविधि" के बीच यंत्रवत संबंध प्रकट करते हैं.
Abstract
अन्तर्ग्रथनी फांक dopamine में अपनी रिहाई के बाद अपने पूर्व और बाद synaptic 1 लक्ष्य के माध्यम से अपने जैविक गुणों डालती है. dopamine संकेत प्रसार 2-3, कोशिकी 4 एंजाइमों, और झिल्ली 5 ट्रांसपोर्टरों द्वारा समाप्त होता है. dopamine न्यूरॉन्स की पेरी synaptic फांक में स्थित dopamine ट्रांसपोर्टर, एक आवक dopamine प्रवाह (तेज) के माध्यम से जारी amines साफ करता है. dopamine ट्रांसपोर्टर भी विपरीत दिशा में काम करने के लिए एक जावक परिवहन या 5 dopamine के तपका बुलाया प्रक्रिया में अंदर से बाहर करने के लिए amines जारी कर सकते हैं. 20 से अधिक साल पहले Sulzer एट अल बताया dopamine ट्रांसपोर्टर गतिविधि के दो मोड में काम कर सकते हैं: आगे (तेज) (तपका) और रिवर्स 5. ट्रांसपोर्टर के माध्यम से तपका के माध्यम से जारी neurotransmitter dopamine की एक बड़ी राशि को बाह्य अंतरिक्ष में ले जाने के लिए, कर सकते हैं और कोशिकी dopamine घंटे में एक प्रमुख विनियामक भूमिका निभा दिखाया गया है6 omeostasis. यहाँ हम वर्णन कैसे एक साथ पैच दबाना और amperometry रिकॉर्डिंग millisecond समय संकल्प के साथ तपका तंत्र जब झिल्ली क्षमता नियंत्रित किया जाता है के माध्यम से जारी dopamine को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस के लिए, पूरे सेल वर्तमान और oxidative संकेतों (amperometric) एक साथ मापा एक Axopatch 200B एम्पलीफायर (आण्विक उपकरण, पूरे सेल वर्तमान रिकॉर्डिंग के लिए 1000 हर्ट्ज पर एक कम पास Bessel फिल्टर सेट के साथ) का उपयोग कर रहे हैं. है है लिए कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग amperometry एक 2 प्रवर्धक (200B Axopatch) से जुड़ा है और प्लाज्मा झिल्ली को आसन्न रखा और 700 एमवी में आयोजित. पूरे सेल और oxidative धाराओं (amperometric) और दर्ज किया जा सकता है संबंध वर्तमान वोल्टेज एक वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है. सामान्य amperometric अंशांकन, जो एकाग्रता के लिए रूपांतरण की आवश्यकता के विपरीत, वर्तमान प्रभावी मात्रा 7 पर विचार किए बिना सीधे सूचना दी है. इस प्रकार, परिणामी डेटाएक कम dopamine तपका सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं क्योंकि कुछ ट्रांसमीटर थोक समाधान के लिए खो दिया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
युगपत वोल्टेज दबाना और amperometry निम्नलिखित लाभ हैं. सभी प्रकार की कोशिकाओं पहुंच रहे हैं और रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कोशिकाओं या न्यूरॉन जहां रिकॉर्डिंग कर रहे हैं की पहचान सरल और सीधा ह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए डॉ. Sanika Chirwa धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (DA026947, DA021471, और NS071122) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
References
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