Mesure Single Cell de la libération de dopamine avec Voltage-clamp simultanée et Amperometry
Summary
La technique de mesure ampérométrique la libération de dopamine à partir d'une seule cellule en détectant le courant oxydatif produit par oxydation spontanée dopamine. Pince simultanée de la tension et de la méthodologie ampérométrie révéler la relation mécanique entre l'ensemble «activité» du transporteur de la dopamine et le rôle régulateur de l'activité sur le transport inverse de la dopamine.
Abstract
Après sa libération dans la fente synaptique, la dopamine exerce ses propriétés biologiques par l'intermédiaire de ses objectifs pré-et post-synaptique 1. Le signal de la dopamine se termine par la diffusion de 2-3, enzymes extracellulaires 4 et transporteurs membranaires 5. Le transporteur de la dopamine, située dans la fente péri-synaptique des neurones dopaminergiques efface les amines libérées par un flux entrant de dopamine (absorption). Le transporteur de la dopamine peut aussi fonctionner dans le sens inverse pour libérer des amines de l'intérieur vers l'extérieur dans un processus appelé transport vers l'extérieur ou l'efflux de dopamine 5. . Plus de 20 ans, Sulzer et al ont rapporté le transporteur de la dopamine peut fonctionner en deux modes d'activité: avant (absorption) et inverse (efflux) 5. Le neurotransmetteur libéré par efflux par le transporteur peut transporter une grande quantité de dopamine dans l'espace extracellulaire, et il a été montré à jouer un rôle majeur dans la régulation extracellulaire de dopamine homeostasis 6. Nous décrivons ici comment patch-clamp et l'enregistrement simultanés ampérométrie peut être utilisé pour mesurer la dopamine libérée par l'intermédiaire du mécanisme d'efflux avec une résolution temporelle millisecondes lorsque le potentiel de la membrane est contrôlée. Pour cela, l'ensemble de la cellule courante et à l'oxydation (ampérométrique) signaux sont mesurés simultanément en utilisant un amplificateur Axopatch 200B (Molecular Devices, avec un ensemble de Bessel passe-bas du filtre à 1.000 Hz pour l'ensemble des cellules d'enregistrement en cours). Pour l'enregistrement d'une électrode ampérométrique fibre de carbone est reliée à un second amplificateur (200B Axopatch) et est placé à côté de la membrane plasmique et maintenu à +700 mV. Les cellules entières et à l'oxydation (ampérométrique) courants peuvent être enregistrées et la relation courant-tension peut être généré à l'aide d'un protocole échelon de tension. Contrairement à l'étalonnage d'habitude ampérométrique, qui exige la conversion de la concentration, le courant est directement signalé sans tenir compte de la 7 fois le volume efficace. Ainsi, les données qui en résultentreprésentent une limite inférieure à efflux de dopamine parce que certains émetteur est perdu à la solution en vrac.
Protocol
Representative Results
Discussion
Simultanée voltage-clamp et ampérométrie présente les avantages suivants. Tous les types de cellules sont accessibles et peuvent être utilisés pour l'enregistrement. L'identification des cellules ou neurones où les enregistrements sont effectués est simple et direct. En particulier, si la cellule est marquée par fluorescence par addition d'un marqueur fluorescent pour la protéine d'intérêt à l'expérimentateur peut facilement sélectionner la cellule cible ou des neurones. La configurati…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Chirwa Sanika à l'examen critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (DA026947, DA021471 et NS071122).
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
References
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