동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정
Summary
amperometric 기술은 자연 도파민의 산화에 의해 생성 된 산화 전류를 검출하여 하나의 세포에서 도파민 릴리스를 측정합니다. 동시 전압 클램프 및 amperometry 방법론은 도파민 수송과 도파민의 역방향 전송에서이 활동의 규제 역할의 전체 '활동'사이의 기계론의 관계를 알 수있다.
Abstract
시냅스 갈라진 틈, 도파민에 출시 된 이후의 사전 및 사후 신경 목표 1을 통해 자사의 생물학적 특성을 발휘. 도파민 신호는 확산 2-3, 세포 효소 4, 막 수송 (5)에 의해 종료됩니다. 도파민 뉴런의 사망시 신경 분열에 위치한 도파민 수송은 안쪽 도파민 유량 (통풍 관)를 통해 출시 아민을 지 웁니다. 도파민 수송은 바깥쪽으로 교통이나 도파민 5 유출이라는 프로세스에서 내부에서 외부로 아민을 공개 역방향으로 작업 할 수 있습니다. . 앞으로 (통풍 관) 및 역방향 (유출) 5 : 20 년 이상 전 Sulzer 외는 도파민 수송이 두 활동의 모드에서 작동 할 수 있습니다 발표했다. 전송을 통해 유출을 통해 발표 신경 전달 물질은 세포 공간으로 도파민 많은 양의 이동 할 수 있으며, 세포 도파민 H의 주요 규제 역할을 보여왔다omeostasis 6. 여기 동시 패치 클램프 및 amperometry 녹음이 막 잠재력이 통제 밀리 초 시간 해상도 유출 메커니즘을 통해 출시 도파민을 측정하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 경우 전체 세포 현재와 산화 (amperometric) 신호는 Axopatch 200B 앰프 (분자 장치, 전체 셀 현재 기록은 1,000 Hz에서 로우 패스 베셀 필터가 설정된)를 사용하여 동시에 측정합니다. 탄소 섬유 전극을 기록 amperometry는 두 번째 앰프 (Axopatch 200B)에 연결되어 있고 플라즈마 막에 인접 배치하고 700 뮤직 비디오에서 개최 때문입니다. 전체 셀과 산화 (amperometric) 전류가 기록 할 수 있으며, 전류 전압 관계는 전압 단계 프로토콜을 사용하여 생성 할 수 있습니다. 농도로 변환을 필요로하는 일반적인 amperometric 보정 달리, 현재는 효과적인 볼륨 7 고려하지 않고 직접보고됩니다. 따라서, 결과 데이터일부 송신기는 대량 솔루션으로 손실되기 때문에 도파민 유출에 하한을 나타냅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
동시 전압 클램프와 amperometry은 다음과 같은 이점이 있습니다. 모든 세포 유형은 액세스 할 수 있습니다 및 녹음에 사용할 수 있습니다. 녹음이 완료되어있는 셀이나 신경 세포의 식별은 간단하고 간단합니다. 셀이 휘황 관심 단백질에 형광 태그를 추가하여 표시하는 경우 특히, 실험 쉽게 대상 셀이나 신경을 선택할 수 있습니다. 실험 구성은 패치 피펫을 통해, 또는 목욕 솔루션 10이 요?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 원고의 중요한 검토 박사 Sanika Chirwa 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (DA026947, DA021471 및 NS071122)에 의해 지원되었다.
Materials
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 |
References
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