Udarbejdelse af parasagittal skiver til undersøgelse af Dorsal-ventrale Organization of the Rodent Medial entorhinal cortex
Summary
Vi beskriver procedurer for forberedelse og elektrofysiologiske optagelse fra hjernen skiver, der opretholder dorsal-ventral akse mediale entorhinal cortex (MEC). Fordi neurale kodning af placeringen følger en dorsal-ventral organisation i MEC, disse procedurer lette efterforskningen af cellulære mekanismer, der er vigtige for navigation og hukommelse.
Abstract
Beregning i hjernen afhængig neuroner reagerer hensigtsmæssigt på deres synaptiske input. Neuroner er forskellige i deres komplement og distribution af membran ionkanaler, der bestemmer, hvordan de reagerer på synaptiske input. Imidlertid er forholdet mellem disse cellulære egenskaber og neuronal funktion i at opføre dyr ikke godt forstået. En løsning på dette problem er at undersøge topografisk organiseret neurale kredsløb, hvor placeringen af de enkelte neuroner kort på de oplysninger, de koder eller beregninger, de foretager 1. Forsøg med denne fremgangsmåde foreslår principper for tuning af synaptiske reaktioner underliggende oplysninger kodning i sensoriske og kognitive kredsløb 2,3.
Den topografiske organisering af rumlige repræsentationer langs dorsal-ventral akse mediale entorhinal cortex (MEC) giver en mulighed for at etablere relationer mellem cellulære mekanismer og beregninger important for geografisk kognition. Neuroner i lag II gnaver MEC kode placering ved hjælp af grid-lignende fyre felter 4-6. For neuroner findes i dorsale positioner i MEC afstanden mellem de individuelle affyringstider felter, som danner et gitter, er af størrelsesordenen 30 cm, hvorimod neuroner ved progressivt mere ventrale positioner denne afstand øges til mere end en meter. Adskillige undersøgelser har afsløret cellulære egenskaber af neuroner i lag II MEC, der som afstanden mellem gitteret fyres områder, også variere i henhold til deres dorsal-ventral position, hvilket antyder, at disse cellulære egenskaber er vigtige for rumlig beregning 2,7-10.
Her beskriver vi procedurer for forberedelse og elektrofysiologiske optagelse fra hjernen skiver, der opretholder dorsal-ventral omfanget af MEC muliggør undersøgelse af topografiske organisation biofysiske og anatomiske egenskaber MEC neuroner. Dorsal-ventrale position identificeres neurons forhold til anatomiske landmærker er vanskeligt at fastslå præcist med protokoller, som bruger vandrette skiver af MEC 7,8,11,12, da det er vanskeligt at opstille referencepunkter for den nøjagtige dorsal-ventral placering skive. De procedurer, vi beskriver muliggør nøjagtig og konsistent måling af placeringen af registrerede celler langs den dorsale-ventrale akse MEC samt visualisering af molekylære gradienter 2,10. Procedurer er blevet udviklet til anvendelse med voksne mus (> 28 dage) og er med held blevet anvendt med mus op til 1,5 år. Med justeringer de kunne bruges med yngre mus eller andre gnaverarter. Et standardiseret system af forberedelse og måling vil hjælpe systematisk undersøgelse af de cellulære og mikrokredsløb egenskaber af dette område.
Protocol
Discussion
For at lette undersøgelse af MEC kredsløb egenskaber, der følger en dorsal-ventral organisation, vi har beskrevet her i detaljer en fremgangsmåde til fremstilling af en parasagittal skive præparat, der bevarer den dorsale-ventrale omfang MEC.
Kritiske trin
Fjernelse af hjernen fra dyret. Vær særlig omhyggelig med at undgå at lægge pres på hjernen. Dette er mere vigtigt end hurtig fjernelse af hjernen.
U…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takke følgende for deres støtte: Commonwealth Scholarship Kommissionen England finansiering (HP), EPSRC (HP), BBSRC (MFN) og EU-Marie Curie-aktioner (MFN).
Materials
| Cutting ACSF(mM) | Standard ACSF(mM) | Internal solution (mM) | CASNumber | Supplier Catalogue Number | |
| NaCl | 86 | 124 | 7647-14-5 | Sigma S9888 | |
| NaH2PO4 | 1.2 | 1.2 | 13472-35-0 | Sigma 71505 | |
| KCl | 2.5 | 2.5 | 10 | 7447-40-7 | Sigma P3911 |
| NaHCO3 | 25 | 25 | 144-55-8 | Fischer S/4240 | |
| Glucose | 25 | 20 | 50-99-7 | Sigma G5767 | |
| Sucrose | 75 | 57-50-1 | Sigma S5016 | ||
| CaCl2 | 0.5 | 2 | 10043-52-4 | VWR 190464K | |
| MgCl2 | 7 | 1 | 2 | 7786-30-3 | Sigma 63020 |
| K Gluconate | 130 | 299-27-4 | Sigma G4500 | ||
| HEPES | 10 | 7365-45-9 | Sigma H3375 | ||
| EGTA | 0.1 | 67-42-5 | Sigma E4378 | ||
| Na2ATP | 2 | 34369-07-8 | Sigma A7699 | ||
| Na2GTP | 0.3 | 36051-31-7 | Sigma G8877 | ||
| NaPhospho-Creatine | 10 | 19333-65-4 | Sigma P7936 | ||
| Biocytin (optional) | 2.7 | 576-19-2 | Sigma B4261 |
Table 1. Cutting ACSF, standard ACSF and K-Gluconate internal solution recipes.
References
- O’Donnell, C., Nolan, M. F. Tuning of synaptic responses: an organizing principle for optimization of neural circuits. Trends Neurosci. 34, 51-60 (2011).
- Garden, D. L. F., Dodson, P. D., O’Donnell, C., White, M. D., Nolan, M. F. Tuning of synaptic integration in the medial entorhinal cortex to the organization of grid cell firing fields. Neuron. 60, 875-889 (2008).
- Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick. Journal of Neuroscience. 25, 1924-1934 (2005).
- Hafting, T., Fyhn, M., Molden, S., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Microstructure of a spatial map in the entorhinal cortex. Nature. 436, 801-806 (2005).
- Sargolini, F. Conjunctive representation of position, direction, and velocity in entorhinal cortex. Science. 312, 758-762 (2006).
- Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. -. B. Grid cells in mice. Hippocampus. 18, 1230-1238 (2008).
- Giocomo, L. M., Zilli, E. A., Fransén, E., Hasselmo, M. E. Temporal frequency of subthreshold oscillations scales with entorhinal grid cell field spacing. Science. 315, 1719-1722 (2007).
- Giocomo, L. M., Hasselmo, M. E. Time constants of h current in layer II stellate cells differ along the dorsal to ventral axis of medial entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 28, 9414-9425 (2008).
- Burgalossi, A. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70, 773-786 (2011).
- Dodson, P. D., Pastoll, H., Nolan, M. F. Dorsal-ventral organization of theta-like activity intrinsic to entorhinal stellate neurons is mediated by differences in stochastic current fluctuations. J. Physiol. (Lond). 589, 2993-3008 (2011).
- Nolan, M., Dudman, J., Dodson, P., Santoro, B. HCN1 channels control resting and active integrative properties of stellate cells from layer II of the entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 27, (2007).
- Boehlen, A., Heinemann, U., Erchova, I. The range of intrinsic frequencies represented by medial entorhinal cortex stellate cells extends with age. Journal of Neuroscience. 30, 4585-4589 (2010).
- Klink, R., Alonso, A. Morphological characteristics of layer II projection neurons in the rat medial entorhinal cortex. Hippocampus. 7, 571-583 (1997).
- van Groen, T. Entorhinal cortex of the mouse: cytoarchitectonical organization. Hippocampus. 11, 397-407 (2001).
- Dolorfo, C. L., Amaral, D. G. Entorhinal cortex of the rat: organization of intrinsic connections. The Journal of Comparative Neurology. 398, 49-82 (1998).
