Utarbeidelse av Parasagittal Slices for etterforskningen av Dorsal-ventral Organisering av Rodent Medial entorhinal cortex
Summary
Vi beskriver prosedyrer for utarbeidelse og elektrofysiologisk registrering fra hjernen skiver som opprettholder dorsal-ventral aksen av medial entorhinal cortex (MEC). Fordi nevrale koding av plassering følger en dorsal-ventral organisasjon innenfor MEC, disse prosedyrene lette etterforskningen av cellulære mekanismer som er viktige for navigasjon og hukommelse.
Abstract
Beregningen i hjernen er avhengig av nevroner svarer riktig på sine synaptiske innganger. Nerveceller ulik komplement og distribusjon av membran ionekanaler som bestemmer hvordan de reagerer på synaptiske innganger. Imidlertid er forholdet mellom disse cellulære egenskaper og neuronal funksjon i oppfører dyr ikke godt forstått. En tilnærming til dette problemet er å undersøke topografisk organisert nevrale kretser i hvilken posisjon de enkelte nevroner kartene inn på informasjonen de kode eller beregninger de utfører en. Eksperimenter ved hjelp av denne tilnærmingen foreslå prinsipper for tuning av synaptiske svar underliggende informasjon koding i sensoriske og kognitive kretser 2,3.
Den topografiske organisering av romlige representasjoner langs dorsal-ventral aksen av medial entorhinal cortex (MEC) gir en mulighet til å etablere relasjoner mellom cellulære mekanismer og beregninger important for romlig erkjennelse. Nevroner i lag II av gnager MEC kode plassering ved hjelp av grid-aktig skyte felt 4-6. For nevroner som finnes på dorsal stillinger i MEC avstanden mellom de enkelte skyte felt som danner et rutenett er i størrelsesorden 30 cm, mens for nevroner ved gradvis mer ventrale posisjoner denne avstanden øker til mer enn 1 meter. Flere studier har avdekket cellulære egenskaper av nerveceller i lag II av MEC som, i likhet avstanden mellom rutenettet skyte felt, også variere i henhold til deres dorsal-ventral posisjon, noe som tyder på at disse cellulære egenskapene er viktige for romlig beregning 2,7-10.
Her beskriver vi rutiner for forberedelse og elektrofysiologisk registrering fra hjernen skiver som opprettholder dorsal-ventral omfanget av MEC slik undersøkelse av topografisk organisering av biofysiske og anatomiske egenskaper MEC nerveceller. Dorsal-ventral posisjon identifisert neurons forhold til anatomiske landemerker er vanskelig å etablere nøyaktig med protokoller som bruker horisontale skiver av MEC 7,8,11,12, som det er vanskelig å etablere referansepunkter for den eksakte dorsal-ventral plasseringen av stykket. Prosedyrene vi beskriver mulig nøyaktig og konsistent måling av plassering av innspilte celler langs dorsal-ventral aksen av MEC, samt visualisering av molekylære gradienter 2,10. Prosedyrene er utviklet for bruk sammen med voksne mus (> 28 dager) og har blitt ansatt med mus opptil 1,5 år gammel. Med justeringer de kunne brukes med yngre mus eller andre gnagere. Et standardisert system for utarbeidelse og måling vil hjelpe systematisk undersøkelse av de cellulære og microcircuit egenskapene til dette området.
Protocol
Discussion
For å lette etterforskningen av MEC krets eiendommer som følger en dorsal-ventral organisasjon vi har beskrevet her i detalj en prosedyre for å produsere en parasagittal skive forberedelse som bevarer dorsal-ventral omfanget av MEC.
Kritiske trinn
Fjerne hjernen fra dyret. Vær spesielt forsiktig for å unngå press på hjernen. Dette er viktigere enn rask fjerning av hjernen.
Slicing. Slice bør vær…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takke følgende for deres støtte: Commonwealth Scholarship Commission Storbritannia finansiering (HP), EPSRC (HP), BBSRC (MFN) og Den europeiske union Marie Curie Actions (MFN).
Materials
| Cutting ACSF(mM) | Standard ACSF(mM) | Internal solution (mM) | CASNumber | Supplier Catalogue Number | |
| NaCl | 86 | 124 | 7647-14-5 | Sigma S9888 | |
| NaH2PO4 | 1.2 | 1.2 | 13472-35-0 | Sigma 71505 | |
| KCl | 2.5 | 2.5 | 10 | 7447-40-7 | Sigma P3911 |
| NaHCO3 | 25 | 25 | 144-55-8 | Fischer S/4240 | |
| Glucose | 25 | 20 | 50-99-7 | Sigma G5767 | |
| Sucrose | 75 | 57-50-1 | Sigma S5016 | ||
| CaCl2 | 0.5 | 2 | 10043-52-4 | VWR 190464K | |
| MgCl2 | 7 | 1 | 2 | 7786-30-3 | Sigma 63020 |
| K Gluconate | 130 | 299-27-4 | Sigma G4500 | ||
| HEPES | 10 | 7365-45-9 | Sigma H3375 | ||
| EGTA | 0.1 | 67-42-5 | Sigma E4378 | ||
| Na2ATP | 2 | 34369-07-8 | Sigma A7699 | ||
| Na2GTP | 0.3 | 36051-31-7 | Sigma G8877 | ||
| NaPhospho-Creatine | 10 | 19333-65-4 | Sigma P7936 | ||
| Biocytin (optional) | 2.7 | 576-19-2 | Sigma B4261 |
Table 1. Cutting ACSF, standard ACSF and K-Gluconate internal solution recipes.
References
- O’Donnell, C., Nolan, M. F. Tuning of synaptic responses: an organizing principle for optimization of neural circuits. Trends Neurosci. 34, 51-60 (2011).
- Garden, D. L. F., Dodson, P. D., O’Donnell, C., White, M. D., Nolan, M. F. Tuning of synaptic integration in the medial entorhinal cortex to the organization of grid cell firing fields. Neuron. 60, 875-889 (2008).
- Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick. Journal of Neuroscience. 25, 1924-1934 (2005).
- Hafting, T., Fyhn, M., Molden, S., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Microstructure of a spatial map in the entorhinal cortex. Nature. 436, 801-806 (2005).
- Sargolini, F. Conjunctive representation of position, direction, and velocity in entorhinal cortex. Science. 312, 758-762 (2006).
- Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. -. B. Grid cells in mice. Hippocampus. 18, 1230-1238 (2008).
- Giocomo, L. M., Zilli, E. A., Fransén, E., Hasselmo, M. E. Temporal frequency of subthreshold oscillations scales with entorhinal grid cell field spacing. Science. 315, 1719-1722 (2007).
- Giocomo, L. M., Hasselmo, M. E. Time constants of h current in layer II stellate cells differ along the dorsal to ventral axis of medial entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 28, 9414-9425 (2008).
- Burgalossi, A. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70, 773-786 (2011).
- Dodson, P. D., Pastoll, H., Nolan, M. F. Dorsal-ventral organization of theta-like activity intrinsic to entorhinal stellate neurons is mediated by differences in stochastic current fluctuations. J. Physiol. (Lond). 589, 2993-3008 (2011).
- Nolan, M., Dudman, J., Dodson, P., Santoro, B. HCN1 channels control resting and active integrative properties of stellate cells from layer II of the entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 27, (2007).
- Boehlen, A., Heinemann, U., Erchova, I. The range of intrinsic frequencies represented by medial entorhinal cortex stellate cells extends with age. Journal of Neuroscience. 30, 4585-4589 (2010).
- Klink, R., Alonso, A. Morphological characteristics of layer II projection neurons in the rat medial entorhinal cortex. Hippocampus. 7, 571-583 (1997).
- van Groen, T. Entorhinal cortex of the mouse: cytoarchitectonical organization. Hippocampus. 11, 397-407 (2001).
- Dolorfo, C. L., Amaral, D. G. Entorhinal cortex of the rat: organization of intrinsic connections. The Journal of Comparative Neurology. 398, 49-82 (1998).
